[发明专利]一种基于转录组测序挖掘黄连小檗碱生物合成相关基因的方法

说明书

本发明公开了一种基于转录组测序挖掘黄连小檗碱生物合成相关基因的方法，包括：观察小檗碱的分布，并测定黄连各组织中的生物碱成分与含量；提取黄连四个组织的总RNA，构建转录组数据集，过滤组装后获得黄连Unigene库并功能注释，分析差异表达基因并筛选与异喹啉生物碱生物合成相关酶基因功能相同的差异表达基因；将筛选后的差异表达基因的FPKM值与生物碱含量进行相关性分析，选取与小檗碱含量相关的基因作为其合成相关基因。本发明成功构建出了四个组织的转录组数据库，并挖掘出13个参与黄连小檗碱生物合成的关键候选基因，为分析黄连中异喹啉生物碱生物合成的分子机制奠定了基础，也为利用基因工程技术提高黄连中小檗碱含量提供了遗传资源和技术支持。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于转录组测序挖掘黄连小檗碱生物合成相关基因的方法。

背景技术

黄连(Coptis chinensis Franch.)为毛茛科(Ranunculaceae)黄连属(Coptis)的多年生草本植物，又名味连、川连、鸡爪连。中药黄连为黄连的干燥根茎，具有清热燥湿，泻火解毒，抗氧化等作用，在临床上应用广泛，中医常用于主治温病热甚心烦，湿热痞满，湿热下痢等。研究表明，黄连中的主要活性成分是生物碱，包括小檗碱、药根碱、黄连碱和巴马汀化合物。其中，小檗碱是黄连中最主要的生物碱之一，对痢疾志贺氏菌、葡萄球菌和链球菌具有很强的抗菌生物活性，同时具有抗炎作用，以及良好的药理学特性，如抑制糖尿病，癌症和血压。黄连中的小檗碱，无论是在学术界还是医药界都是一种十分流行的药物，因此，对小檗碱的研究十分重要。

目前，药用资源的匮乏和品质问题已经成为了限制新医药的开发以及临床治疗的最大因素。黄连为我国重要的药用植物资源，作为常用中药，临床使用相对较为广泛。由于小檗碱在植物体中的含量相当低，加之黄连属植物入药部位(根茎)生长缓慢，同时小檗碱的生物利用度较差，这些严重限制了其应用和发展。在生物碱生物合成中，关于小檗碱生物合成的研究最多，但是关于参与调控小檗碱生物合成的关键基因以及转录因子尚不够清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于转录组测序技术，深层次挖掘与小檗碱合成相关的结构基因与转录调控因子的方法，完善了黄连转录组数据资源，为后期研究异喹啉生物碱化合物合成代谢途径中的关键酶基因的克隆、表达分析和功能研究提供基因资源，同时也为解析黄连异喹啉生物碱物质合成途径中的分子机制奠定基础，也为利用基因工程技术提高黄连小檗碱含量提供了资源和技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于转录组测序挖掘黄连小檗碱生物合成相关基因的方法，所述方法包括：

步骤1、观察小檗碱在黄连组织中的分布与沉积部位，并测定黄连各组织器官中的生物碱成分与含量；

步骤2、分别提取黄连的叶片、叶柄、根茎和不定根的总RNA，分别测序并构建转录组数据集，获得原始数据；

步骤3、对步骤2获得的原始数据进行过滤后得到干净数据，将所述干净数据进行组装处理，获得黄连的Unigene库；

步骤4、对步骤3中黄连的Unigene库中的基因进行功能注释，并分析在黄连的叶片、叶柄、根茎和不定根中差异表达的基因；

步骤5、对步骤4分析得到的差异表达基因进行功能注释，并根据功能注释筛选与异喹啉生物碱生物合成途径中相关酶基因功能相同的差异表达基因；

步骤6、将步骤5筛选后得到的差异表达基因的表达水平FPKM值与生物碱各成分的含量进行相关性分析，选取其中与小檗碱含量具有相关性的基因，作为黄连小檗碱生物合成相关的候选基因。

进一步的，所述步骤1中使用荧光显微镜观察小檗碱在黄连组织中的分布与沉积部位，并用高效液相色谱法测定黄连的叶片、叶柄、根茎和不定根中生物碱的组成成分以及含量。