[发明专利]一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体和工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体和工程菌及应用，属于酶工程技术领域。本发明的分枝杆菌(Mycobacterium)LY‑1的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体是将3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的320位天冬氨酸突变成了酪氨酸，得到3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体KstD1；以pET32a为表达质粒，以大肠杆菌BL21为表达宿主，实现分枝杆菌LY‑1中3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的异源表达，重组菌大肠杆菌BL21‑pET32a‑KstD1能够在短时间内转化高浓度的C1,2‑位脱氢甾体化合物，且转化率达到98％，降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于酶基因工程及酶工程技术领域，具体涉及一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体和工程菌及应用，能对甾体化合物的C1，2位进行脱氢成为C1,2-位脱氢甾体化合物。

背景技术

甾体激素药物具有广泛的治疗作用，常被用于治疗过敏、骨质疏松、激素水平紊乱等疾病，现已成为仅次于抗生素的世界第二大类药物，常见的甾体类药物有黄体酮，氢化可的松，地塞米松，醛固酮等。甾体化合物是在自然界广泛分布的类萜脂质家族，该化合物通常均具有环戊烷多氢菲的碳架结构，即甾体母核。甾体母核C1,2位的脱氢能够提高甾药的亲和力，从而强化甾药的药效和作用时间，该过程主要用于皮质激素类药物，如氢化波尼松等。利用化学方法也可以进行C1,2位脱氢反应，但存在收率低、毒性强、环境污染等缺点，而微生物转化法则是一个更好的选择，使其成为合成甾体激素类药物中至关重要的一步反应。

3-甾酮-△1-脱氢酶(KstD)属于黄素蛋白酶类，大都位于细胞膜上，能在3-甾酮化合物的C1和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性，在甾体药物的生产上发挥着重要作用。KstD酶所参与的反应为不可逆反应，存在于多种微生物中，且往往存在多个KstD同工酶，其底物偏好性存在不同。

随着基因技术的不断发展，越来越多的研究人员对KstD酶进行了更为深入的研究，异源表达3-甾酮-△1-脱氢酶和改造该酶的例子很多，但普遍存在的跨膜区域仍是限制其活性表达的重要瓶颈，异源表达后，酶的活性较低，只能转化低浓度的底物，且转化时间较长。

因此采取基因组学、生物信息学分析和代谢工程操作相结合的方法，挖掘和鉴定更多的新的易可溶性表达的酶基因并进行改造，筛选出能对高底物浓度进行转化或者降低转化时间的KstD酶是具有非常重要的工业意义。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种分枝杆菌LY-1的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体和工程菌及应用，具体涉及来自于分枝杆菌(Mycobacterium)LY-1的3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD突变体的氨基酸序列以及其编码该蛋白的核苷酸序列。将3-甾酮-Δ1-脱氢酶的关键活性D320位点，突变成了酪氨酸，获得高酶活突变体，将其突变体基因在宿主细胞如大肠杆菌中异源表达，成功实现了3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的高活性的表达以及对高浓度甾体化合物高效的转化，为其进一步的工业化应用奠定基础。

本发明的第一个目的是，提供一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

在一种可选实施方式中，所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体kstD1是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本分枝杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶kstD的第320位天冬氨酸替换为酪氨酸得到的。

在一种可选实施方式中，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因来源于分枝杆菌Mycobacterium sp LY-1CGMCC No.13031。

本发明的另一个目的是提供编码所述突变体的基因，其核苷酸序列为以下任意一种：

a)如SEQ ID N0:3所示的碱基序列；

b)编码由如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。