[发明专利]一种基于表面增强拉曼散射的超灵敏生物芯片及其制备方法

权利要求书

1.一种基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，其步骤如下：

(1)将1mL Au NPs溶液用去离子水稀释8～15倍，进行第一次离心，然后将沉淀分散到1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液中，进行第二次离心，再将沉淀分散于1mL乙醇中；随后，在90～150μL Au NPs的乙醇溶液中加入1～1.2mL二氯甲烷和1.8～2mL去离子水，将得到的混合溶液剧烈摇晃30～60s；再缓慢加入400～450μL正己烷，此时在液体表面形成了致密的Au NPs单层膜，用亲水处理后的硅片将Au NPs单层膜捞起；重复上述制备致密的Au NPs单层膜的操作1次，然后用上述硅片再次将致密的Au NPs单层膜捞起，从而在硅片上组装2层Au NPs单层膜，从而得到SERS活性基底；将SERS活性基底浸入20～25μM的巯基十一酸乙醇溶液中1.5～3.0h，取出后用乙醇溶液冲洗2～4次；然后在SERS活性基底上滴加10～15μL、10～12μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液，4℃孵育4～6小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；最后向上述基底表面滴加10～15μL、质量百分数3～5％的BSA的PBS溶液，4℃孵育1.5～3.0小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底；

(2)将200～300μL、0.1mM 4MBA的乙醇溶液加入到1mL Ag NPs溶液中，27～32℃搅拌8～12h，8000～9000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到4MBA修饰的Ag NPs溶液，记为Ag@4MBA溶液；再将30～50μL、10～12μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液加入到1mL Ag@4MBA溶液中，4℃孵化4～6h，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中；最后向上述溶液中加入50～80μL、质量百分数3％～5％的BSA的PBS溶液孵化1.5～3.0小时，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到SERS免疫探针溶液；

(3)向步骤(1)得到的SERS免疫基底表面滴加10～15μL浓度为1fg/mL～1ng/mL的SARS-CoV-2spike antigen protein的PBS溶液，37℃孵育2～3小时后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；然后滴加15～20μL步骤(2)制备的SERS免疫探针溶液，4℃孵育2～3小时，然后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到具有三明治免疫夹心结构的基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片，第一层为SERS免疫探针，中间层为SARS-CoV-2spikeantigen protein，最后一层为SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底。

2.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，其特征在于：是将0.985mg氯金酸与0.365g十六烷基三甲基溴化铵混合后用去离子水定容至10mL，然后在300rpm下快速加入0.6mL、10×10^-3M硼氢化钠溶液，搅拌2分钟，在27℃下放置3h以确保反应完全，得到十六烷基三甲基溴化铵包覆的金纳米团簇溶液；将2mL、200×10^-3M十六烷基三甲基氯化铵溶液与1.5mL、100×10^-3M抗坏血酸溶液、50μL十六烷基三甲基溴化铵包覆的金纳米团簇溶液混合，待反应物完全溶解后再加入2mL、0.5×10^-3MHAuCl₄溶液，在27℃下反应15分钟，然后14500rpm离心30分钟重新悬浮于1mL、20×10^-3M十六烷基三甲基氯化铵溶液中，得到粒径为10nm的金纳米颗粒种子溶液；将2mL、100×10^-3M十六烷基三甲基氯化铵溶液与130μL、10×10^-3M抗坏血酸溶液溶液和10μL、10nm金纳米颗粒种子溶液混合，然后加入2mL、0.5×10^-3MHAuCl₄溶液，在27℃下反应10min，14500rpm离心10min，得到Au NPs溶液。