[发明专利]基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用

说明书

本发明公开了基于kosakonia sp.菌株生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用，重组菌是在kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断GDP‑fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY；kosakonia sp.菌自身具有合成富含岩藻糖组分的岩藻多糖(FucoPol)，且菌株内GDP‑fucose池潜力巨大，为2’‑岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池，成分安全，合成的2’‑岩藻糖基乳糖安全性好，能够用于食品和医药品的原料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，还涉及利用重组菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法和应用。

背景技术

婴儿配方奶粉是除母乳喂养外为婴儿提供或补充营养的最佳选择，为了缩小与母乳之间的营养成分差距，近年来关于母乳寡糖的研究越来越多。人乳中包含了众多的寡糖成分，约50％是岩藻糖基化的寡糖，其中2’-岩藻糖基乳糖((2’-FL))最为丰富。已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为GRAS级别的HMOs，可作为高档婴配奶粉的营养补充剂，是目前最具商业价值的一种岩藻糖基乳糖。

而生产2’-岩藻糖基乳糖的方式主要包括了化学合成法、酶法合成、全细胞催化以及生物发酵法。生物发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖是未来生产2’-岩藻糖基乳糖的主要方法之一，利用微生物自身代谢途径合成供体GDP-L-Fuc，进一步在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下催化合成2’-FL。目前，研究人员已在多种工业菌株中，包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等，构建了2’-FL的合成途径。大肠杆菌具有产量高的优点，但是大肠肝会产生毒素，安全性差。且需要在大肠杆菌中同时重组表达多个基因，外源基因表达过多稳定性差且对宿主菌的代谢造成一定负担。因此，急需寻找一种新的宿主作为2’-岩藻糖基乳糖的底盘菌株。

Kosakonia sp.CCTCC M2018092菌株是在中国西南重庆地区的温泉水分离得到，菌株能够高产富含岩藻糖组分的岩藻多糖(FucoPol)，充分说明底盘菌株内GDP-fucose池的巨大潜力，这为2’-岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌；本发明的目的之二在于提供利用kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的方法；本发明的目的之三在于提供所述重组菌在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌，所述工程菌是在kosakonia sp. 菌株中敲除wcaj基因阻断GDP-fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futC和过表达乳糖透过酶lacY使代谢流向2’-岩藻糖基乳糖。

优选的，所述岩藻糖基转移酶futC的序列经密码子优化，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9 所示的第1171位至2073位所示。

优选的，所述岩藻糖基转移酶futC的5’端融合有麦芽糖结合蛋白MBP；所述麦芽糖结合蛋白MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第1～1170位。

优选的，所述乳糖透过酶lacY的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，所述敲除wcaj基因的方法是基于CRISPR-Cas9的wcaj基因敲除。