[发明专利]氧化苦参碱在降低银屑病患者脂毒性所致表皮细胞死亡中的应用

权利要求书

1.氧化苦参碱在降低银屑病患者脂毒性所致表皮细胞死亡中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(一)患者信息收集

发明人于2018年12月至2019年5月在宁夏医科大学总医院门诊部招募临床或组织学检查确诊为重度斑块型银屑病的患者32例，健康志愿者29例；所有患者均按中国江苏嘉泰天青药业集团有限公司临床试验注册指南(CHICCTR-TRc-14004301)，静脉注射天青复欣(氧化苦参碱98％，0.6g(100mL)/d)共8周；采用银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分、银屑病总体评估(PGA)评分和体表面积(BSA)评分对银屑病患者的严重程度进行量化。此外，皮肤科生活质量指数(DLQI)问卷被用来衡量皮肤问题对这些患者的生活造成了多大的影响；记录患者的年龄、性别、家族病史、血常规、肝、肾生化检查结果；同时符合以下标准的患者包括：严重斑块型银屑病患者(PASI评分≥为12)；病程至少半年的患者，以及之前接受过至少一个疗程的系统治疗但没有明显改善的患者；排除标准如下：有严重肝肾损害、精神疾病、造血功能障碍或其他严重器质性疾病的志愿者；怀孕的患者；在两个月内接受免疫抑制或大剂量糖皮质激素或维甲酸治疗的患者；对氧化苦参碱过敏的患者；所有参与者，包括健康对照和一周内接受过任何皮肤护理或洗剂的银屑病患者；所有健康参与者的年龄和性别与银屑病患者相似；这些健康的志愿者没有任何免疫性疾病的病史，也没有任何皮肤病；所有样本和临床信息均在知情同意的情况下获得；本研究是经宁夏医科大学总医院机构评审委员会批准，按照“赫尔辛基宣言”进行的；

(二)代谢组学研究样品的采集和制备

从银屑病患者皮损和氧化苦参碱治疗8周后的同一部位采集银屑病患者皮肤标本，切取1平方厘米的表皮和真皮；采集后将所有皮肤标本放入液氮中15min，然后转入-80℃长期保存；每个样本取皮肤20mg，加入200L消毒水。然后将样品分别进行3次匀浆和冰上超声波处理5min；加入1mL甲醇-乙腈-水(V：V：V＝2：2：1)和1g/mL内标(2-氯-L-苯丙氨酸)提取液，匀浆5min，4℃超声处理3次；所有样品在-40℃炖煮1h后，在-4℃下以10000转/分的速度离心15min，然后将提取液真空干燥。在超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)代谢组学分析中，样品用100L 50％乙腈溶液短暂超声悬浮；气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)分析中，样品再悬浮在30mL甲氧胺盐酸盐(20mg/mL吡啶中)中；样品在80℃孵育30min后，用40mLN，O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)和1％三甲基硅基二乙胺(TMCS)在70℃下衍生化1.5h，然后逐渐冷却至室温；为了进行质量控制(QC)样品制备，将每种提取物等体积(10l)混合在一起；在质控样品中加入另外5升饱和脂肪酸甲酯，用于GC-MS分析；

(三)脂质组学研究的样品制备

每例取皮肤组织20mg，与200L水混合，冰水匀浆。取30L匀浆，与含有内标的960L提取溶剂混合；旋涡30s后，样品在冰水中超声10min。然后样品在3000rpm下以4℃离心15min，将500μL的上清液转移到新鲜试管中；其余样品加入500μL的甲基叔丁基醚，再次提取脂质，再取出500μL的上清液，此步骤重复了一次；所有上清液混合在一起，在37℃的真空浓缩器中干燥，干燥样品在200μL的50％甲醇二氯甲烷中重组后，在12000转/分，4℃下离心15分钟；将75μL的上清液转移到新鲜玻璃瓶中进行LC-MS脂质组学分析。将所有样品的上清液等分(10μL)混合制成质控样品；

(四)LC-MS代谢组学数据采集

采用1290UHPLC和AB Sciex TripleTOF 6600高分辨质谱仪对所有皮肤提取物进行代谢组学分析；采用UPLC BEH酰胺柱(2.1×100mm，1.7m)分离代谢物；流动相A为25mm/L醋酸铵-25mm/L氢氧化氨水溶液，流动相B为乙腈；洗脱梯度为0～0.5min为95％B，0.5～7.0min为95％～65％B，7.0～8.0min为65％～40％B，8.0～9.0min为40％B，9.0～9.1min为40％～95％B，9.1～12.0min为95％B，流速设定为0.5mL/min，柱温和自动取样器温度分别设置为25℃和4℃，正、负离子模式下的进样量均为1L；TripleTOF 6600质谱仪在采集软件(Analyst TF 1.7，AB Sciex)的控制下以信息依赖采集(IDA)模式运行；在每个循环中，选择12个强度最高的前驱体离子进行MS2分析，碰撞能为30eV；电子喷雾电离源条件为：气体1为60psi，气体2为60psi，幕气为35psi，源温度为600℃，去团电位为60V，离子喷雾电压浮动为5000V或-4000V；

(五)GC-MS代谢组学数据采集

GC-TOF-MS分析使用Agilent 7890气相色谱仪和Pegasus HT飞行时间质谱仪，采用DB-5MS毛细管色谱柱(30m*250μm*0.25μm)；每例标本注射1μL，采用非劈裂方式，载气为氦气，前吹入吹扫流量为3mL/min，通过塔的气体流量为1mL/min；初始温度为50℃，保温1min，然后以20℃/min的速率升至310℃，然后保温6min；前注入温度为280℃，传输线温度为280℃，离子源温度为250℃；在电子碰撞模式下，能量为-70eV；质谱数据以全扫描方式获得，m/z范围为50-500，在溶剂延迟4.85min后，以每秒12.5个光谱的速率进行；

(六)LC-MS/MS脂质组学数据采集

LC-MS/MS脂质组学数据采集采用Agilent 1290UHPLC-AB Sciex TripleTOF6600质谱仪；使用Kinetex C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相A为60％乙腈水溶液，含10mmol/L甲酸铵；流动相B为10％乙腈和90％异丙醇，外加10mm/L甲酸铵水溶液，最终浓度为0.5mm/L，洗脱梯度为0～12.0min，40％～100％B；12.0～13.5min，100％B；13.5～13.7min，100％～40％B；13.7～18.0min，40％B；柱温45℃，自动进样温度4℃，正、负离子进样量分别为2μL和6μL；三重飞行时间质谱仪在Analyst TF软件的控制下以IDA模式运行；选择了12个前驱体离子在45eV的碰撞能下进行MS/MS分析；源条件分别为：气体1为60psi，气体2为60psi，窗帘气体为30psi，源温度为600℃，去团电位为100V，离子喷雾电压浮动为5000V或-4500V；

(七)LC-MS和GC-MS代谢组学数据分析

采集的LC-MS原始数据用ProteoWizard软件转换成mzXML格式，用XCMS进行处理；GC-MS原始数据用Chroma TOF(V4.3，LECO)软件处理；数据预处理步骤包括峰识别、峰对齐、峰提取、保留时间校正和峰积分；为了保证代谢组学数据的重现性和可靠性，对质控样品中峰的相对标准偏差(RSD)大于30％进行了去除；通过与HMDB(WWW)在线数据库中的保留时间(RT)和质荷比(m/z)指标进行比较，确定了LC-MS分析中剩余的峰。Hmdb.ca)、KEGG(www.genome.jp/kegg)和内部库；GC-MS数据中的其余峰与Leco-FiehnRtx5数据库匹配，峰值强度用曲线下面积进行量化，然后，生成由保留时间值、m/z值和峰强度组成的三维数据矩阵；对数据矩阵进行进一步处理，去除50％以上样本中有缺失值的峰，并用最小值的一半填充剩下的缺失值，然后，通过将数据归一化到内标的峰值强度来生成新的数据矩阵；为了解SLE患者与正常人代谢组学特征的差异，采用主成分分析(PCA)和正交投影潜在结构判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析方法；

(八)定量脂质组学数据分析

使用基于响应因子(RF)的方法对获得的脂质组学原始数据进行分析和量化(20).简而言之，原始数据文件由ProteoWizard中的“msConvert”程序转换为mzXML格式。然后，将mzXML文件加载到内部R程序LipidAnalyzer中进行数据处理；利用XCMS进行MS1峰检测、峰比对和峰注释，然后，生成包含峰面积、RT和m/z信息的表格；然后，提取每个特征的MS/MS谱图，并与内部MS/MS谱库匹配进行脂质鉴定；测定各脂质标准品和稳定同位素标记内标物[d7-PE(15：0/18：1)]的线性标准曲线，得到各脂质类的Rf值；将稳定同位素标记内标曲线的斜率除以脂类标准曲线的斜率，计算出每一类脂质的Rf值；进行LC-MS/MS脂质组学数据采集，在Rf值测定后立即使用与前文报道相同的方程实现所鉴定脂质的绝对定量(20)；

(九)细胞培养和细胞活力测定

所有细胞系在DMEM+10％胎牛血清中培养；将细胞接种于96孔板中，加入1.6mM PA诱导48h，同时与氧化苦参碱共同孵育细胞；CCK8法测定细胞存活率；

(十)蛋白质印记

取正常人、银屑病患者氧化苦参碱或阿昔洛汀治疗前后的皮肤组织标本和培养细胞，用添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA裂解缓冲液裂解；用抗PCNA抗体、Caspase-3、Bcl-2和b-actin进行蛋白质印记实验；

(十一)统计分析

使用Microsoft Excel和R软件版本3.5.1进行统计分析；应用氧化苦参碱治疗后特定时间点(X周)的病情改善指数按以下公式计算：(0周PASI评分-X周PASI评分)/(0周PASI评分)；疾病复发定义为0周时PASI评分超过PASI评分的50％；采用主成分分析(PCA)方法，对正常人、银屑病患者氧化苦参碱治疗前后的临床指标、代谢组学和脂类组学进行比较，分析氧化苦参碱治疗前后银屑病患者的临床指标、代谢组学特征和脂质组学特征的差异；OPLS-DA分析中VIP值gt；1(投影中的变量重要性)和经Benjamin-Hochberg校正后的单变量分析(t检验或配对t检验)中q＞0.05的小分子被认为是显著改变的代谢物或脂质；用Spearman相关性描述小分子代谢物与疾病严重程度指数之间的关系；皮脂分级预测银屑病严重程度的方法采用岭回归和GLMNET软件包。