[发明专利]基于关键指标提高准确性的单细胞测序方法

说明书

本发明公开一种基于关键指标提高准确性的单细胞测序方法。建立了10X Genomics和BD Rhapsody平台样本制备方法并加以优化确定了关键参数，确定单细胞转录组测序技术样本的评价标准；通过建立细胞系对不同单细胞转录组测序平台的结果分析,进而解决单细胞转录组测序技术存在可比性和重复性差、缺乏质量控制标准的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因测序技术，更具体涉及单细胞测序方法。

背景技术

自1665年Robert Hooke第一次使用“细胞”形容机体结构以来，细胞一直都是人类密切研究的对象，尽管其种类繁多，但细胞仍是所有生命的基本单位，在生物体中起着极为重要的作用。与此同时随着计算机信息化以及测序技术的出现，特别是高通量测序技术水平的改进，测序成本的下降更是快于摩尔定律，实现了快速、高效、低成本的测序方式(Xuanet al.,2013；Ozsolak,2012)。基于大量细胞或组织进行分析的组学研究蓬勃发展，基因组、转录组(Wang et al.,2009)、蛋白组、表型组(Shendure and Ji,2008)等组学相继出现，慢慢展现了生命体的内在机理，从整体上初步揭示了生物体中各组织器官以及系统的内在联系。

但是人类目前对组学分析、调控的理解几乎都来自于群体层面上进行的研究，需要从大量细胞中提取足够的DNA或者RNA得到的结果只是一群细胞信号的平均值，或者只代表其中占大多数比例的细胞信息，很多低丰度的信息会在整体表征中丢失(Shirai etal.,2014)，例如实体瘤样本中提取的总DNA，50％以上来源于非癌性成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞或巨噬细胞，使得癌细胞的信号可能被隐藏(Navin and Hicks,2011)。同时忽略了单个细胞独有的特性以及细胞间的异质性(Cell heterogeneity)(Kalisky et al.,2011)，并且看似同质的细胞之间基因表达也可存在很大差异，这部分源自基因表达内在的随机性(Stochastic)特征，可对细胞表型产生影响(Huang,2009)，另外有些样品因为稀少或者无法再进行实验室培养，样品量不足以进行组学分析，传统的测序技术遇到了无法逾越的鸿沟。

为了解决传统测序技术的窘境，单细胞测序技术应运而生，它为辨别生物组织中各种细胞类型特征和全面揭示细胞之间基因表达的异质性提供了有力的工具(Tang etal.,2011)，完美的解决了之前困扰科学研究的难题，是对传统组学研究的一次升级，从曾经的“宏观”分析进化到更精确的“微观”研究，可以比以往更全面、分辨率更高地阅读这些细胞功能蓝图。这项技术不仅有助于我们认识细胞之间的差异，还可以为我们提供一个新的比较层面，为更好地理解细胞功能和功能障碍提供了希望。但由于单个细胞中所包含的核酸信息仅仅是皮克级别，无法进行传统的测序分析，因此还需要对其中的DNA或者RNA进行扩增，而无论是细胞分离、核酸扩增还是数据分析这些过程中诸多因素都会导致单细胞测序结果的不准确、重复性差等问题，缺乏对测序结果进行有效评估验证的技术。因此，急需开展单细胞测序的计量技术探索研究，提高单细胞测序的稳定性，降低测序偏差，为单细胞测序的广泛应用和推广提供计量技术策略。