[发明专利]一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种用于治疗β‑地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括HBB表达框；所述HBB表达框包括串联的DNase I高敏位点、启动子、HBB编码基因和增强子；所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；所述HBB编码基因包括T87Q突变。本发明通过精简顺式调控元件的长度、使用突变型HBG启动子、优化启动子长度、对潜在的转录终止信号进行沉默突变等多种手段，开发出了新型慢病毒载体，所述慢病毒载体能够实现β‑珠蛋白过表达，其中HBB表达模块总长度约5kb，与BB305载体相比，载体滴度提高了2～4倍，红系分化后β‑珠蛋白表达水平提高了2倍左右。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

β-地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一，患者体内的β-珠蛋白(β-globin，HBB)编码基因发生突变，造成β-珠蛋白肽链合成不足。血红蛋白作为红细胞运输氧气的载体，是由两条α-珠蛋白链和两条β-珠蛋白链组成的四聚体。HBB基因突变使得血红蛋白的α、β两种亚基比例失衡，无法形成功能性血红蛋白，同时引发溶血性贫血，最终使机体氧气供应严重不足，造成多种器官损伤，重者可危及生命。

当前，临床上广泛实施的β-地中海贫血的治疗手段包括规范化输血、药物治疗、异体造血干细胞移植等。其中，规范化输血仅能缓解症状，不能根治疾病，病人还需长期依赖于祛铁治疗以降低铁过载损伤；此外，长期输血还存在感染病毒的可能性，同时治疗成本高昂。异体造血干细胞移植虽然可以达到根治地中海贫血的目的，但是80％以上的病人难以找到组织相容性抗原匹配的供者，若采用非全相合的造血干细胞进行移植，患者可能产生严重的移植物抗宿主反应，在治疗后需要长期使用免疫抑制剂，生存质量低下。目前普遍认为基因治疗是根治β-地中海贫血的重要替代方法。

针对β-地中海贫血的基因治疗有两种主流方法：1)基于珠蛋白的时空顺序性开关转换过程，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除或敲低该过程中参与调控的BCL11A等基因，从而重新激活HBG1/2(胎儿γ-珠蛋白)；2)通过慢病毒载体整合补偿策略过表达HBB(成人β-珠蛋白)。

其中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术再激活HBG表达的地中海贫血基因治疗应用研究已取得显著进展，但是该方案可能存在一些潜在的问题，基因编辑治疗方法虽然值得期待，但是其安全性和疗效需要进一步验证，目前尚不能取代传统的慢病毒载体基因治疗方法。

用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体根据β-珠蛋白基因簇的调控元件特征，将基因座控制区(locus control region，LCR)的相关核心序列(HS2-3-4，相当于超级增强子)与HBB基因表达框串联，组装成精简的HBB表达模块，反向装载到慢病毒载体上。慢病毒转导造血干细胞后，其装载的表达模块将整合到造血干细胞基因组中，在造血干细胞向红系分化过程中，红系特异性转录因子将识别并结合逐渐开放的HS4-3-2增强子和HBB启动子区域，激活外源性HBB基因的表达。

利用慢病毒载体进行地中海贫血的基因治疗已经有近二十年的研究历程，目前国际同行已经开发出多种慢病毒载体，如BB305、GLOBE、HPV56等，其中，蓝鸟公司基于BB305载体的药物Zynteglo已经获欧盟批准上市，报价177万美元，成为目前全球第二昂贵的药物。虽然慢病毒载体的HBB整合补偿策略已经在临床试验中取得显著成效，但是当前的商业化慢病毒载体存在诸如LCR元件较大导致慢病毒包装滴度低、载体生产成本高等问题，仍然有很大的改进空间。

目前使用的慢病毒载体基本上是10年前设计的，过去10年来由于基因组学、二代测序技术的进步和慢病毒生物学的不断发展，对慢病毒载体进行新的技术创新的条件已经成熟，有利于开发出效果更好、成本更低的慢病毒载体治疗药物。

发明内容