[发明专利]一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16‑1，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述广谱型多糖降解酶rAly16‑1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQID NO.1所示；密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16‑1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致；广谱型多糖降解酶rAly16‑1是首次发现的属于PL‑8家族的褐藻胶裂解酶，该酶能够降解包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸皮肤素(HS/DS)、黄原胶、褐藻胶在内的多种酸性多糖，且以褐藻胶为最适底物。

技术领域

本发明涉及一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

技术背景

生物质多糖(Polysaccharide)在自然界分布极广，几乎存在于所有生物体中^[1]，如构成动植物细胞壁的肽聚糖和纤维素^[2]；作为动植物储藏养分的糖原和淀粉；甲壳类动物外骨骼中的结构多糖几丁质^[3]。研究表明，部分多糖及其系列寡糖具有抗凝血、抗氧化^[4,5]、抗肿瘤^[6,7]、抗病毒^[8]、抗辐射等特殊的生物活性，参与分子识别、细胞信号转导与病毒侵染等生理过程^[9_,^10]。多糖降解酶能催化多糖分子内糖苷键断裂并产生低聚合度的寡糖或单糖，是实现高效利用生物质多糖的关键，且用酶催化多糖实现寡糖制备的绿色生产方式具有较大的开发潜力^[11]。随着生物质多糖结构的解析以及大量多糖降解酶的鉴定研究，通过蛋白质工程定制的专一性多糖降解酶分子可获得更高的催化效率、更优的稳定性，但对于复杂的多糖而言，专一性多糖降解酶分子仍具有非常有限的降解活性，使用单一酶难以完成生物质多糖的彻底降解。专一性多糖降解酶已有广泛研究，但仍属于基础研究，关于工具酶的改造、催化特性及应用特色系统分析较少。广谱型多糖降解酶是一类能降解多种多糖的降解酶^[12,13]，能够实现“一酶多能”，目前少见报道，具有较大的开发运用潜力。

褐藻胶是一种来源于褐藻的水溶性酸性多糖，是由α-1,4-L-古罗糖醛酸(α-1,4-L-guluronate，G)和β-1,4-D-甘露糖醛酸(β-1,4-D-mannuronate，M)组成的嵌段高聚物，长链分子中含有均聚(G)n段、均聚(M)n段及(GM)n自由杂聚段。

褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(Polysaccharide Lyase,PL)，通过β消去反应催化糖苷键的断裂，从而生成含不饱和末端结构的低聚糖，并在232nm附近具有特征吸收^[14]。多糖裂解酶系可归类为22个家族，依据对其初级结构疏水区域的分析，褐藻胶裂解酶归属于十二个家族，PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18、PL-31、PL-32、PL-34、PL-36、PL-39，关于属于PL-8家族的褐藻胶裂解酶未见报道。目前，关于褐藻胶裂解酶的资源发掘、生化特征与分子改造等相关研究较多，但其中关于酶的底物选择性、底物降解模式与寡糖生成特性的研究较少，尤其大多数褐藻胶裂解酶仅见其对褐藻胶底物的降解报道^[15,16]，几乎未见报道既能降解褐藻胶的同时又能降解其他多种多糖的广谱型多糖降解酶。整体上，未见关于具有M-专一性的广谱型褐藻胶内切酶的催化特性及相应机制的深入研究，因此缺少相关规律性的机制与认知，并给酶的精确运用及定向分子酶学改造带来困难。

现有技术中，发现一个酶含有多功能模块，从而催化不同多糖底物生成寡糖的特性，但是这种发现仅限于中性多糖(如，琼脂糖、淀粉和卡拉胶等)，在酸性多糖中未见报道。

本研究团队以上问题进行了深入研究，研究对象是分离自四川四姑娘山川贝母根系的放线菌(Streptomyces sp.)CB16。前期的研究发现其能在14种不同多糖为唯一碳源的条件下生长^[17]。

发明内容