[发明专利]一种新型的细菌裂解的方法

说明书

本发明公开了一种新型的裂解细菌的方法，通过向待裂解表达目的重组蛋白的细菌培养液中加入溶菌酶、表面活性剂、核酸酶，混匀，裂解5min～2h，离心，收集上清液，得到重组蛋白；所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或几种的混合物。本发明能够取代使用超声破碎仪的传统机械破碎方式，低成本、高效率地获得细菌裂解液，最终回收目的重组蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型的细菌裂解的方法。

背景技术

在生物技术产业中，大肠杆菌表达系统是外源基因表达蛋白的首选工程菌，也是目前最为广泛应用的经典的原核表达系统，具有遗传背景清晰、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖速度快、蛋白获得率高、成本较低等优点。根据2018年数据，由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中，大肠杆菌表达系统来源的药物占比高达26％，这表明大肠杆菌表达系统在基于蛋白的生物药物生产中应用广泛。

大肠杆菌表达系统通常分为两种途径进行重组蛋白的表达，第一种胞外表达，也称分泌表达，但外源重组蛋白的局限性较高，分泌效率和蛋白产量有限；第二种是胞内表达，也是外源重组蛋白在大肠杆菌中最主要的表达形式，重组蛋白产量通常可以占总生物质的30％。但大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，细胞壁由肽聚糖、脂蛋白、脂多糖等组成，强度较高。细胞壁的特殊结构导致大肠杆菌必须进行细胞破碎后才能进行相应的分离及纯化。

现有的主流型细胞破碎方法可分为机械法和非机械法两大类，前者包括匀浆化、超声波和压力破碎等方法，后者包括生物酶法和化学渗透法等。前者在破碎过程中易造成蛋白活性降低，蛋白结构受到破坏，进而影响重组蛋白产量；生物酶法通过酶降解法破坏细胞壁组分，实验条件温和，破碎效率较高，不影响重组蛋白活性，但碎菌成本较高；化学渗透法可增大细胞壁的通透性，诱使细胞破碎，但操作过程繁琐，重组蛋白获得率较低。在上述方法中，细菌细胞完全破碎也意味着细胞内部基因组DNA被释放。较大分子量的基因组DNA不仅引起细菌破碎液粘度升高，增加生产处理的难度，同时残留的DNA也会影响后续重组蛋白的分离纯化处理。

因此，开发一种新型的细菌裂解的方法，在提高破碎效率的同时，减少蛋白活性的损失，降低生产成本，对提取大肠杆菌内的重组蛋白产物的工艺改进具有重要意义。

发明内容

技术问题：本发明要解决的技术问题是提供一种新型的细菌裂解的方法，不使用机械破碎，不需要从细胞培养基中取出细菌或浓缩细菌，从而有效简化细菌细胞的破碎程序，提高细菌细胞内重组蛋白的获得率与纯度。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种新型的细菌裂解的方法，向待裂解表达目的重组蛋白的细菌培养液中加入溶菌酶，混匀，反应5min～2h；再加入表面活性剂，混匀，反应5min～2h；再加入核酸酶，混匀，反应5min～2h，离心，收集上清液，得到含有目的重组蛋白的混合物，再通过进一步纯化，可以得到目的重组蛋白；

所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或几种的混合物，优选烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺中的一种或两种的混合物。本发明选择烷基葡糖苷作为新型破碎用表面活性剂，该试剂具有以下显著优点：1.该试剂使用纯天然原料生产，具有可再生、无污染的特点；2.该试剂为可生物降解试剂，对环境友好，不会造成环境污染；3.该试剂价格低廉，便于该方法大批量应用及普及；4.相比于其他试剂，该试剂破碎效果极佳，综合效果达到或超过繁琐而昂贵的超声破碎法。