[发明专利]一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子

说明书

本发明的目的在于提供一种优化的牙鲆鱼β‑肌动蛋白启动子，本发明将在牙鲆中广泛表达的β‑肌动蛋白的启动子进行优化进而获得启动效率更强的重组启动子表达载体eGFP‑优β‑肌动蛋白。并且这一新的载体可使外源基因有效转入牙鲆不同细胞系，为鲆鲽鱼类基因功能的研究提供了一种新的途径和方法，为解决鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低提供一种有效的可行的载体，为在细胞水平研究分析基因功能提供高效的手段，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术方法。

技术领域

本发明属于蛋白转录翻译技术领域，具体涉及一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子。

背景技术

β-肌动蛋白是真核细胞中最丰富的蛋白质，在进化过程中非常保守，并且β-肌动蛋白参与关键的生物过程，如转录、mRNA加工和染色质重塑等。它在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测目标基因转录水平以及蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。另外它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。基因表达体系是一个复杂的过程，目前在海水鱼类中还不是很成熟，这已成为在细胞水平上分析和个体水平上研究海水鱼类基因功能的主要瓶颈之一。近年来，科研工作者在海水鱼表达载体构建方面取得了一些进展，但是表达系统的效率还是不足以有效研究水鱼类基因功能。而在载体系统的改造过程中，启动子调控元件起着重中之重的作用，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。因此，从启动子出发，设计强启动子元件，构建成熟高效的表达系统，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，能够更高效的使外源基因在牙鲆细胞系中进行表达，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2的；

本发明所提供的优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，是将核苷酸序列为SEQ ID NO:1的牙鲆启动子进行序列分析，把原序列每隔200bp～300bp长的片段进行删除，进而获取不同的启动子突变体；在进行筛选获得的。

本发明所提供的优化后的启动子用于制备重组表达载体；

本发明再一个方面提供一种将外源基因转染入牙鲆细胞的方法，是使用上述的重组表达载体将外源基因转染入牙鲆细胞。

所述的方法，是待牙鲆细胞汇合度达70％—80％时，把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞培养基中对牙鲆细胞进行转染；培养48h后进行绿色荧光检测，鉴定优化后的启动子启动效率。

本发明方法可将在牙鲆中广泛表达的β-肌动蛋白的启动子进行优化进而获得启动效率更强的重组启动子表达载体eGFP-优β-肌动蛋白。并且这一新的载体可使外源基因有效转入牙鲆不同细胞系，为鲆鲽鱼类基因功能的研究提供了一种新的途径和方法，为解决鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低提供一种有效的可行的载体，为在细胞水平研究分析基因功能提供高效的手段，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术方法。

附图说明

图1：不同突变型牙鲆β-肌动蛋白启动子双荧光报告载体图；

图2：不同突变型β-肌动蛋白启动子在牙鲆胚胎细胞双荧光报告结果图；

图3：不同突变型β-肌动蛋白启动子在牙鲆脑细胞双荧光报告结果图；

图4：eGFP-优β-肌动蛋白和eGFP-β-肌动蛋白的表达效率比较图；

图5：eGFP-优β-肌动蛋白质粒在活体上启动效率图。

具体实施方式

本发明采用的是对β-肌动蛋白启动子自身的不同区域进行长片段缺失分析，进而分别高效的识别出启动子上不同片段对启动子启动活性的贡献，即有效识别启动子上的沉默区域和活性区，进而构建出高活性的启动子。本发明通过对启动子的改造，大大提高了启动子活力，实现了外源蛋白的高效表达，这对于研究海水鱼类基因功能分析等至关重要。