[发明专利]一种汉麻内生菌的分离方法

权利要求书

1.一种汉麻内生菌的分离方法，其特征在于汉麻内生菌的分离方法具体按以下步骤进行：

一、样品的采集：从植株茂盛、无病虫害的汉麻上采集新鲜的叶，每株采集4～5片；

二、样品预处理：将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其叶切成0.25cm×0.25cm的组织块，对组织块的表面进行处理后，表面干燥，得到预处理后的叶片；

三、表面消毒：先用自来水将预处理后的叶片冲洗干净，然后采用下述方法进行表面消毒：先采用0.1％升汞溶液漂洗10～30s，再采用无菌水冲洗3～5次，然后采用75％酒精漂洗30～60s，最后再采用无菌水冲洗3～5次，该次无菌水冲洗后的无菌水保留；在无菌操作条件下将清洗后的叶片切成0.2cm×0.2cm长段，种植于PDA培养基中，在温度为27～29℃的条件下置于温箱静止培养5～7d；然后将保留的冲洗后的无菌水涂于PDA培养基中，继续在温度为27～29℃条件下置于温箱培养，直至表面消毒完全，得到消毒好的叶；

四、汉麻内生菌分离纯化：将消毒好的叶切成小块后分成两份，一份接种于真菌分离培养基中进行组织培养，一份接种于细菌分离培养基中进行组织培养；组织培养方式：每个平板接种4～5个组织块，接种5个平板，将其分成两组分别置于28℃和37℃恒温培养箱中培养3～7d；待组织块周围长出菌落后，采用接种环挑取不同的菌落，划线法接种于同种平板培养基中进行分离培养，反复接种2～3次后，挑取单菌落的菌丝体或细胞在显微镜下观察无杂菌即可确定为纯种菌株；最后将分离纯化的菌株分类合并接种试管斜面培养基中编号保藏。

2.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤一中采集的样品先采用75％乙醇擦拭样品表面，或短时间浸泡、灼烧，使表面干燥后，用石蜡封住切口，放入无菌塑料袋，并保存于低温盒中。

3.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤一中采集的样品当需要保存时，其保存温度为4℃。

4.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤三中先用自来水将预处理后的叶片冲洗的冲洗时间为20min。

5.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤三中所述PDA培养基中土豆的量为200g/L，葡萄糖量为20g/L，琼脂的量为18g/L。

6.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤四中所述真菌分离培养基中土豆的量为200g/L，葡萄糖的量为20g/L，琼脂的量为18g/L。

7.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤四中所述细菌分离培养基中胰蛋白胨的量为15g/L，大豆胨的量为5g/L，氯化钠的量为3g/L，琼脂的量为15g/L。

8.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤四中所述细菌分离培养基的pH为7.2～7.4。