[发明专利]一种RNA 4-巯基尿嘧啶特异标记方法及其应用

说明书

本发明公开了一种RNA 4‑巯基尿嘧啶特异标记方法及其应用，属于核酸化学技术领域，本发明方法利用水合肼对RNA 4‑巯基尿苷进行加成消除的反应机理,在温和的条件下生成了类似于胞嘧啶(C)的结构，RNA在逆转录的过程中原来4sU的位置上发生的A:T配对变为C:G配对，从而对4sU的位置进行单碱基识别。此方法结合测序技术可用于检测天然存在的4sU的位置和研究转录组的动态。

技术领域

本发明属于核酸化学技术领域，具体涉及一种RNA 4-巯基尿嘧啶特异标记方法及其应用。

背景技术

RNA在生命体中是一种重要的生物大分子。在细胞中，RNA处于一个不断转录，加工，降解的动态体系中。为了了解RNA的功能，研究其转录组的动态很有必要。测序技术可以捕获RNA的瞬时信息但是不能直接传递转录组的动态信息。基于此，越来越多的标记试剂，如EU,BrU,4sU等一些易于进行化学修饰的核苷通过代谢转录到新生成的RNA中，结合测序技术，可以用于研究转录组的动态。在这些代谢标记的方法中，由于4sU对细胞的干扰小，容易插到RNA上，所以4sU代谢标记是一种广泛用于研究转录组动态的方法。1978年，4sU首次代谢标记到哺乳动物细胞中，结合测序技术，来评估RNA的降解速率。近几年来，越来越多的化学方法来修饰4sU,通过对4sU的识别来评估转录组的动态。

最初对4sU的识别是通过富集来实现的。4sU可以被一种通过二硫键连接的生物素的吡啶(HPDP-biotin)进行标记，当富集之后，DTT打断二硫键来释放富集到的4sU RNA，但此方法的反应效率很低。随后，研究人员用甲基化的巯基生物素(MTS-bio)对4sU进行反应富集，此反应大大提高了标记效率。即使如此，生化反应富集的方法操作繁琐，会造成实验的重复性差，实用性低，另外，这种方法也不能对4sU进行单碱基识别，致使4sU代谢标记的位点数无法得到。

当前发展的一些方法能够对4sU进行单碱基识别。由于巯基是一种典型的亲核物质，碘代或溴代化合物很容易被巯基进攻。碘乙酰胺(IAA)通过亲核反应对4sU进行修饰产生一种与胞嘧啶结构相似的化合物，此化合物可以与G进行氢键配对，实现对4sU进行单碱基识别。同时，巯基的氧化亲核芳基取代机理也被挖掘出来，同时用氧化剂和亲核试剂对RNA 4sU进行反应在4sU的位置上会产生胞嘧啶或类似于胞嘧啶的结构，也可以对4sU进行单碱基识别。但上述的这些方法的过程复杂，反应条件苛刻，并且用到的氧化剂会对经典碱基造成氧化损伤。

因此，亟需一种温和的、简便的化学方法对4sU进行单碱基识别从而对转录组的动态进行评估。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种RNA 4-巯基尿嘧啶特异标记方法，利用水合肼对4sU的加成消除机理对RNA 4sU进行标记，在4sU的位置上产生T到C的突变，从而实现对4sU进行单碱基识别，该方法反应条件温和，具有良好的生物兼容性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种RNA 4-巯基尿嘧啶特异标记方法，包括：

利用水合肼对RNA 4-巯基尿苷进行加成消除反应，产生类似胞嘧啶的结构；

所述类似胞嘧啶的结构在RNA进行逆转录的过程中与鸟嘌呤配对；

通过核酸测序的手段识别T到C的突变位点，对4-巯基尿苷的位置进行单碱基识别，实现RNA 4-巯基尿嘧啶特异标记。

优选地，所述加成消除反应的条件如下：

以水为溶剂，以DTT作为缓冲液，在50℃的条件下反应1.5h。

优选地，所述逆转录具体操作如下：

将经过加成消除反应后的RNA分别采用逆转录酶ProtoScriptⅡ、SuperScriptⅡ和Bst 3.0进行逆转录。