[发明专利]传染性喉气管炎病毒强毒株及其应用

说明书

本发明涉及一株传染性喉气管炎病毒（ILTV）的分离、鉴定、动物感染模型的建立，属于微生物技术领域。通过对福建省某疑似ILTV感染的病鸡进行ILTV分离、纯化和鉴定后命名为ILTV WF03株，用其纯培养物感染4周龄或8周龄的SPF鸡具有较高的致病力。本发明中的传染性喉气管炎病毒强毒株，具有较强毒力，感染4周龄或8周龄SPF鸡导致典型的ILTV感染临床症状，发病率分别为95%和100%，死亡率分别为40%和27.3%。因此建立的动物感染模型可用作不同药物或预防治疗方法有效性评价或疫苗效力检验用强毒株。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株传染性喉气管炎病毒的分离、鉴定、动物感染模型的建立。

背景技术

传染性喉气管炎病毒（ILTV）属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科传染性喉气管炎病毒属，感染主要引起鸡的死亡和/或产蛋下降，严重的感染往往表现为呼吸困难、喘气、有血样液体咳出，具有很高的致死性，而温和型感染主要表现为黏液性气管炎、鼻炎、结膜炎、不愿活动和低死亡率等多种形式，不论是严重感染还是温和型感染均给生产带来了严重的损失和威胁。

ILTV野毒株的毒力差异很大，有的毒株具有很高的发病率和致死率，属于强毒株，而也有感染后症状轻微或不明显的弱毒株，由于野毒株毒力差异大，建立稳定的可供疫苗效力检验用的动物感染模型十分困难。本发明涉及的一株ILTV强毒株WF03株具有很高的发病率，对4周龄和8周龄SPF鸡的发病率分别为95%和100%，死亡率分别为40%和27.3%，且发病主要以咳血、死亡和呼吸困难为主要临床症状，其评判指标易观察，因此WF03株属于强毒株，且可以用作疫苗效力评价用攻毒毒株。

发明内容

本发明的目的在于构建一株传染性喉气管炎病毒，以及病毒分离、鉴定、动物感染模型的建立，具体包括以下步骤：

一株传染性喉气管炎病毒株，所述毒株命名为ILTV WF03株，已于2021年2月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202117，中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉，武汉大学。

上述毒株的构建方法包括以下步骤：

（1）取临床疑似ILTV感染鸡处死后，无菌采集气管和喉头组织，将采集的病料组织以1:5的比例加入PBS研磨后冻融3次，12000 r/min离心10 min后以0.45 μm滤膜过滤，将过滤液以尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后继续孵化7 d，无菌收获尿囊膜以1:5的比例（质量体积比g/mL）加入PBS研磨后冻融3次，离心取上清继续以尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚，再传代2次后，观察鸡胚病变；发现盲传3代后鸡胚尿囊膜呈现出灰白色痘斑，疑似ILTV病毒感染，按照中华人民共和国农业行业标准NY/T 556-2002 鸡传染性喉气管炎诊断技术经鉴定为ILTV病毒；

（2）将鉴定过的ILTV分离株采用有限稀释法在10日龄鸡胚中进行纯化，将疑似ILTV病毒液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种6枚，继续孵化7日后，检测尿囊膜，尿囊膜出现灰白色斑的为阳性，取最高稀释度的阳性尿囊膜研磨后制备成病毒液，采用同样方式继续纯化2次；将纯化的ILTV分离株命名为ILTVWF03株。

利用上述毒株建立SPF鸡人工感染模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用ILTV WF03株对8周龄或4周龄的SPF鸡进行气管攻毒，攻毒后连续观察临床症状14天。

所述攻毒的剂量0.2 mL/羽，病毒含量为10^4.0 EID₅₀。

本发明的优点在于：