[发明专利]一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2，所述拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2的氨基酸序列为SEQ ID No:1；本发明还公开了一种编码拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2的基因，所述抑菌蛋白Spctl‑2基因的核苷酸序列为SEQ ID No:2；本发明还公开一种基于所述拟穴青蟹C型凝集素Spctl‑2的重组抑菌蛋白rSpctl‑2；本发明还公开了所述重组抑菌蛋白rSpctl‑2在制备防控河弧菌侵染中的应用；本发明还公开了所述重组抑菌蛋白rSpctl‑2在制备防控藤黄微球菌中的应用；本发明还公开了该重组抑菌蛋白rSpctl‑2的制备方法。本发明利用大肠杆菌生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计免疫增强剂的剂型提供更多选择。

技术领域

本发明涉及水产品病害生物防治领域，尤其涉及一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用。

背景技术

细菌感染引起的相关病害，导致养殖过程中拟穴青蟹存活率低，从而给相关养殖产业造成巨大的损失。目前对拟穴青蟹病害的防治主要采用抗生素和人工合成抗菌药来防治由于规模化、集约化养殖所引起的病害。细菌性疾病是青蟹养殖中普遍发生的一种水产疾病，主要由河弧菌和藤黄微球菌等引起，使拟穴青蟹存活率低。防治该病的药剂以抗生素为主，但长期使用也造成抗药性增强，药效减弱的问题。因此，寻找通过提高拟穴青蟹自身的免疫力来抵抗日益严重的病害具有重大意义。

Spctl-2蛋白存在于拟穴青蟹体内，可以给拟穴青蟹提供对细菌的广谱抗性，主要通过特征性糖识别域，该结合位点带有一个Ca²⁺以与糖接触，参与无脊椎动物的发育及其先天免疫反应的调控、吞噬作用，微生物凝集等。迄今为止，已从拟穴青蟹中，分离纯化出了多种C型凝集素，如Spctl-1、Spctl-2等。目前，还尚未见采用拟穴青蟹C型凝集素作为动物源免疫增强剂在防控拟穴青蟹养殖病害上的报导。

发明内容

为了解决上述相关领域的不足，本发明提供一种拟穴青蟹C型凝集素及其制备方法和应用。

本发明提供一种拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2，所述蛋白Spctl-2的氨基酸序列为SEQ ID No：1。

本发明还提供编码上述拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No：2。

本发明还提供一种含有上述拟穴青蟹C型凝集素Spctl-2基因的表达载体。

本发明还提供一种重组抑菌蛋白r Spctl-2在制备关于细菌的感染防治免疫增强剂中的应用，所述重组蛋白r Spctl-2抑制河弧菌和藤黄微球菌。

一种重组抑菌蛋白r Spctl-2的制备方法.包括以下步骤:

步骤1，对所示的核昔酸序列两瑞添加Ncol/Xhol酶切位点和His标签序列后，进行全基因合成，得到基因片段:

步骤2，用Ncol/Xhol双酶切载体pET32a和步骤1所得的基因片段，回收纯化，将双酶切后的基因片段与载体pET32a连接，得连接产物并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑取阳性克隆进行培养，得含有r Spctl-2基因的重组质粒，即重组表达载体；

步骤3，将步骤2所述的含有重组质粒的大肠杆菌菌株，于0.01mM的IPTG，30℃，4h的诱导条件下，制备得到上清表达的重组蛋白r Spctl-2.

步骤4，将步骤3的上清纯化后，得到重组蛋白r Spctl-2。

本发明与现有技术相比而言，具有以下有益效果:

1)本发明提供一种制备拟穴青蟹C型凝集素重组蛋白r Spctl-2的方法以及利用该方法制备的蛋白的抑菌活性，填补了动物源抗菌蛋白在防治这拟穴青蟹病害中的空白。