[发明专利]用于分离生物体内特异性蛋白-DNA复合体的方法、融合蛋白及其制备方法

说明书

用于分离生物体内特异性蛋白‑DNA复合体的方法、融合蛋白及其制备方法，涉及生物工程技术领域，本发明的关键之处在于利用标签的纳米抗体与目的蛋白中带有的相同标签结合，将微球菌核酸酶带到目的蛋白与染色质结合位点处，通过核酸酶的激活使染色质裂解，从而释放出蛋白‑DNA复合体，消化蛋白后即可对DNA进行测序，确定结合位点。本发明可应用于蛋白质‑DNA相互作用的研究中，在研究蛋白质特异结合DNA序列时，不需要额外提供抗原特异性的抗体且步骤简单，为含有相同标签的不同蛋白质寻找生物体内染色质结合序列提供了新的技术手段。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种用于分离生物体内特异性蛋白-DNA复合体的方法、融合蛋白及其制备方法。

背景技术

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）一直是体内研究蛋白质-DNA相互作用的主要方法，其过程包括细胞与甲醛交联固定、染色质片段化、引入抗体富集、收集与目标蛋白结合的染色质进行分析，最终获得蛋白质在基因组上的结合位点。ChIP 技术也存在一定的局限性，例如需要高度特异性抗体，交联过程中或者无效抗体造成的假阴性信号，甲醛固定过程中的假阳性信号等。

近些年来，基因组技术的创新与进步为人们更好地了解蛋白质在染色质上的分布提供了新的工具。比如核酸酶靶向切割和释放(CUTRUN)技术，其主要通过靶标特异性一抗和pAG-微球菌核酸酶(pAG-MNase)分离体内特异性蛋白-DNA复合体，利用Ca²⁺控制酶的活性，切割下来的DNA片段建库测序，从而获得蛋白特异结合的DNA片段，但此方法需要高特异性的目标蛋白一抗。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够用于分离生物体内特异性蛋白-DNA复合体的融合蛋白的制备方法，采用该方法制备的融合蛋白分离蛋白-DNA复合体，可以简化操作步骤且不需要用到抗原特异性抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：用于分离生物体内特异性蛋白-DNA复合体的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

一、纳米抗体核酸酶融合蛋白表达载体的构建：

将与目的蛋白具有相同标签的纳米抗体构建于合适的载体上，获取微球菌核酸酶的DNA序列，将所述微球菌核酸酶的DNA序列插入载体中纳米抗体序列的前面或后面，构建纳米抗体微球核酸酶融合蛋白表达载体；

二、纳米抗体核酸酶融合蛋白的纯化：

将步骤一中构建的纳米抗体微球核酸酶融合蛋白表达载体于合适的表达系统中表达后，提取纳米抗体核酸酶融合蛋白并进行纯化处理。

在本发明的一个实施例中，所述纳米抗体为绿色荧光蛋白纳米抗体。

在本发明的一个实施例中，上述步骤二中的表达系统为大肠杆菌表达系统。

在本发明的一个实施例中，步骤一中，先将绿色荧光蛋白纳米抗体构建在pADL-10b载体上, 得到pADL-10b-nanobody质粒，之后通过无缝克隆将微球菌核酸酶的DNA序列插入pADL-10b-nanobody载体中纳米抗体序列的后面，并通过PCR扩增绿色荧光蛋白纳米抗体-微球核酸酶融合基因序列，之后再次采用无缝克隆将绿色荧光蛋白纳米抗体-微球核酸酶融合基因序列构建到pET28a质粒上，从而得到绿色荧光蛋白纳米抗体-微球核酸酶融合蛋白表达载体。

其中，在步骤一中，是从密码子优化后的微球菌核酸酶DNA片段中克隆获取微球核酸酶的DNA序列，用以进行PCR扩增的引物为：

pADL-10-YJ-homo-FP：

CCGGGAGGCCAAGGCGGTGGTTCTGAGGGTGGTGGCTCCggtggagggGCAACTTCAAC ；

pADL-10-YJ-homo-RP：

ATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTATTAGTGATGATGATGATGATG) 。