[发明专利]一种细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料及制备方法和应用

权利要求书

1.一种细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，采用链霉亲和素表面功能化修饰EDC活化后的Fe₃O₄-COOH纳米颗粒得到SA-Fe₃O₄纳米颗粒；

培养高表达A549细胞，并在对数期收集A549细胞并用Sulfo-NHS-Biotin在细胞表面标记生物素，通过离心超声，得到细胞膜悬浮液；

具体的，细胞膜悬浮液通过以下过程制得：

A549细胞在ham’s F-12 Kaighn’s modification培养基中添加10% v /v胎牛血清和1%青霉素/链霉素，37℃，5% CO₂湿化培养箱中培养；

A549细胞用低温PBS洗涤，除去含胺培养基，细胞悬液中加入不透膜生物素试剂Sulfo-NHS-Biotin1.0 mg, 4℃孵育30分钟，细胞用含有100 mmol·L^-1甘氨酸的PBS洗涤，收集细胞于1500 rpm离心5分钟；

用PBS溶液重复洗涤三次后，将生物素标记后的细胞重悬于50 mmol·L^-1 Tris-HCl，pH= 7.4，并通过超声波破碎，过滤，得到粗膜沉淀物，然后将粗膜沉淀物用10 mL PBS溶液洗涤离心，过滤，得到膜沉淀物，取膜沉淀物使其悬浮在PBS溶液中，得到2~6 mg mL⁻¹细胞膜悬浮液；

将细胞膜悬浮液与SA-Fe₃O₄纳米颗粒发生非共价键键合，制得细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料；

采用Sulfo-NHS-Biotin制备细胞膜外表面标记了生物素的细胞膜制剂，并与链霉亲和素表面功能化的Fe₃O₄-COOH纳米颗粒发生非共价键键合，制得细胞膜反向包覆磁性纳米材料，从而通过反向吸附制备了一种能够将位于细胞膜内区域的药物作用靶点即EGFR膜内激酶区暴露出来的细胞膜反向包覆磁性纳米药物筛选材料；

细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料具体制备过程如下：将SA-Fe₃O₄纳米颗粒分散后，加入细胞膜悬浮液中，在4 ℃下震荡混合60 min，制备细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料。

2. 根据权利要求1所述的一种细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，SA-Fe₃O₄纳米颗粒具体制备过程如下：将Fe₃O₄-COOH纳米颗粒经2-(N-morpholino)乙烷磺酸缓冲液洗涤，然后采用EDC MES缓冲液在室温下振荡激活，再采用新鲜2-(N-morpholino)乙烷磺酸缓冲液淋洗后，将Fe₃O₄-COOH纳米颗粒与链霉亲和素在室温下共同孵育18-24 小时，然后使用甘氨酸溶液猝灭多余的链霉亲和素的活性；最后使用磷酸缓冲盐溶液多次淋洗反应产物并经外部磁场分离，冷冻干燥，得到SA-Fe₃O₄纳米颗粒；其中，Fe₃O₄-COOH纳米颗粒与链霉亲和素的比为10 mg：450 μg。

3. 根据权利要求1所述的一种细胞膜反向包覆细胞膜磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，Fe₃O₄-COOH纳米颗粒制备过程如下：将Fe₃O₄@SiO₂@NH₂、甲苯、丁二酸酐混合，在氮气保护下，加热至78-82℃，待丁二酸酐全部溶解后，搅拌12-14 h，洗涤，干燥，得到Fe₃O₄-COOH纳米颗粒；其中，Fe₃O₄@SiO₂@NH₂、甲苯与丁二酸酐的比为10 mg：10 mL：40 mg。