[发明专利]BVDV纳米抗体及其制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术检测领域，公开了一种抗BVDV‑重要功能蛋白纳米抗体及其制备方法和应用，主要通过构建BVDV‑NS5A表达载体，纯化NS5A蛋白；使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离羊驼外周血淋巴细胞，通过巢式PCR获得VHH基因，构纳米抗体噬菌体展示文库，目的基因插入率为90.8％，文库容量为1.02×10⁷CFU/mL，经M13K07噬菌体救援建立纳米抗体噬菌体展示文库容量为1.68×10¹⁶CFU/mL；以BVDV‑重要功能蛋白作为目标抗原，对扩繁得到的噬菌体展示文库进行三轮亲和筛选，从该文库筛选出与E0/E2/NS5A/NS3蛋白特异性结合纳米抗体，通过ELISA检测其反应原性，特异性良好的纳米抗体进行测序，分析序列，进而获得该特异性纳米抗体的基因，构建原核表达载体，对其进行原核表达、纯化和鉴定，得到所需纳米抗体Nb‑Y1、Nb‑Y2、Nb‑Y3，并通过Western blot验证纳米抗体和BVDV重要功能蛋白的反应原性。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及抗BVDV重要功能蛋白蛋白纳米抗体的制备方法与应用，首先表达并纯化获得BVDV-NS5A蛋白，使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离淋巴细胞及血清，通过构纳米抗体噬菌体展示文库，使用BVDV-E0、E2、NS5A、NS3四种功能蛋白筛选特异性纳米抗体，ELISA检测其反应原性，并对特异性良好的纳米抗体进行表达和纯化，运用Wb验证纳米抗体的特异性。

背景技术

牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine Viral Diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的传染病。各种年龄的牛都易感染、以犊牛易感性最高。传染源主要是病畜的分泌物、排泄物、血液和脾脏等，传播方式为直接接触或间接接触方式两种。患牛表现为发病急，体温突然升高至40～42℃，食欲废绝，消化道粘膜损伤严重，最初常表现为水样腹泻，后期粪便中带血和粘膜，死亡率可高达90％。因此BVD-MD是养牛业中具有重大经济意义的疾病之一，也是进口检疫中应重点防范的疾病之一。据文献报道该病呈世界性分布，目前中国地区已有新疆、内蒙古、宁夏、山东、四川等20多个省市自治区不同程度的流行。

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属的单股正链RNA病毒，呈圆形有囊膜，与猪瘟病毒和羊边界病毒为同属病毒。BVDV主要有四个结构蛋白，衣壳蛋白(C)，囊膜蛋白(Erns，E1和E2)和7个非结构蛋白(P7，NS2/NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。

1993年，Hamers等在骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的抗体，称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体分子大小仅为15kDa、单链可变片段(30kDa)、Fab片段(60kDa)和完整抗体(150kDa)。尽管可以根据CDR2长度以及CDR1或framework-2中另一个半胱氨酸的位置在单峰骆驼中区分不同的亚家族，但所有纳米抗体都属于同一序列家族，与III族人类VH3的家族家族密切相关；并且这种抗体仅有重链的可变区，有水溶性好、耐高温、易在原核系统中表达、组织穿透性强、高稳定性、甚至可口服吸收而不被降解、抗原结合高亲合性等优势都说明纳米抗体是理想的研究工具，可用于开发复杂的纳米生物技术；本试验接种羊驼后，可以将VHH基因克隆到噬菌粒载体中，然后可以通过针对抗原的噬菌体展示选择抗原特异性VHH。由于其体积小、自然可溶的特性，以及独特的靶向替代表位的能力，使得纳米体在肿瘤靶向、诊断、甚至体内治疗等方面都非常有吸引力。

发明内容

本发明目的在于提供一种制备抗BVDV重要功能蛋白特异性纳米抗体的方法；

目前抗体获得方法有单克隆抗体，核糖体展示库，噬菌体展示库等，其中应用最广泛的技术是噬菌体展示库；

本技术筛选的纳米抗体较常规抗体具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性好、易表达和免疫原性低等特点，比常规抗体用途更广。

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种制备抗BVDV纳米抗体的方法及其应用。