[发明专利]用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的用于检测非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取DNA；

S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针；

S3、结果判定：若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值35，则判断为阳性；若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值45则判断为阴性；若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性；

所述检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针包括第一组引物对p72-F1和p72-R1及探针p72-P1，和第二组引物对p72-F2和p72-R2及探针p72-P2，其中，所述p72-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述p72-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述p72-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述p72-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述p72-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述p72-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述非洲猪瘟病毒为24个基因型的非洲猪瘟病毒，所述24个基因型的非洲猪瘟病毒及其p72基因如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ为报告基团和淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述实时荧光qPCR的反应体系包括0.1～2.5mmol/L dNTP Mixture、1～5×PCR缓冲液、1.0～2.5mmol/L MgCl₂、0.05～0.2U/μL Taq DNA聚合酶、0.2～0.8μmol/L引物对、0.16～0.28μmol/L探针和DEPC处理水。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光qPCR的反应体系为25μL包括含有终浓度为0.2mmol/L dNTP Mixture、1×PCR缓冲液、2mmol/LMgCl₂、0.1U/μL TaqDNA聚合酶、0.4μmol/L引物对、0.24μmol/L探针。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，实时荧光qPCR扩增的程序95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸30秒，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM荧光信号。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，同时设置以如SEQ IDNO.7所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。