[发明专利]一种Hsf1基因敲除小鼠模型的建立及应用

权利要求书

1.一种Hsf1基因敲除小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA(guide RNA)并进行筛选；

(2)通过PCR扩增出sgRNA(small guide RNA)转录模版，得到四个上游引物和一个下游引物；

(3)将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选，筛选切割有效的sgRNA，从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验；

(4)运用PCR扩增出转录spCas9 mRNA的模板，接着体外转录Cas9 mRNA；

(5)将体外转录得到的sgRNA与Cas9 mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内，剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定，代孕小鼠分娩得到的小鼠记为F0代基因敲除小鼠；

(6)选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠；

(7)选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠，剪取鼠尾组织并测序，最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。

2.根据权利要求1所述的一种Hsf1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中四个上游引物序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求1所述的一种Hsf1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(6)中还包括结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。

4.根据权利要求1所述的一种Hsf1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(7)之后还包括步骤(8)，运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序，通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合，同时进行基因序列比对判断碱基片段缺失。

5.权利要求1-4任一项所述一种Hsf1基因敲除小鼠模型的构建方法在骨肉瘤研究中的应用。

6.权利要求1-4任一项所述一种Hsf1基因敲除小鼠模型的构建方法

获得的小鼠模型的敲除Hsf1基团的细胞。

7.一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，sgRNA序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5所示。

8.SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5所示序列在建立Hsf1基因敲除小鼠中的应用。