[发明专利]一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用

权利要求书

1.一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，其特征在于，包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ、针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ和针对猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ；

其中，特异性引物Ⅰ的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

特异性引物Ⅱ的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

特异性引物Ⅲ包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，其特征在于，特异性引物Ⅰ的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1：上游引物ATCCAAACAGCAGGTAAA；

SEQ ID NO.2：下游引物CTGAGGGAATAGCAAGGT。

特异性引物Ⅱ的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.3：上游引物GATGGCCGAATCCCTGAG；

SEQ ID NO.4：下游引物GTTAAGATGTGCCGTGGG。

特异性引物Ⅲ的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.5：上游引物TTGTTGGCGAGGAGGGTA；

SEQ ID NO.6：下游引物AGCGGGCACCGAAATACC。

3.如权利要求1所述的猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，其特征在于，非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ是针对非洲猪瘟病毒的VP72基因序列进行设计；牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ是针对牛病毒性腹泻病毒的5’端非编码区基因序列进行设计；猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ是针对猪圆环病毒2型的ORF1基因序列进行设计。

4.一种如权利要求1～3任一项所述的猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物在试剂盒中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在试剂盒中，SEQ ID NO.1～6所示6条引物的浓度分别为15pmol/μL；6条引物的摩尔比为1:1:1:1:1:1。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在上述试剂盒中，还包括阳性对照品、阴性对照品、2×One Step TB Green RT-PCR BufferⅢ和酶混合物；所述阳性对照品为含有SEQID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列的pMD-18T混合质粒，阴性对照品为无核酸酶水。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，混合酶为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶的混合物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比1:1混合。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，试剂盒为多重荧光PCR检测试剂盒。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，多重荧光PCR扩增的反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s 94℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸20s；40个循环；循环结束后，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却。