[发明专利]酮酸还原酶在合成手性芳香2-羟酸中的应用

权利要求书

1.一种酮酸还原酶在催化合成手性芳香2-羟酸中的应用，其特征在于所述酮酸还原酶氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述酮酸还原酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：以含酮酸还原酶编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的酮酸还原酶上清液和含葡萄糖脱氢酶编码基因的工程发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的葡萄糖脱氢酶上清液为催化剂，以苯乙酮酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，以NAD⁺为辅酶，以100mM、pH7.0的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液为反应介质，在35℃、700rpm条件下反应，反应完全后，获得含(R)-扁桃酸的反应液；所述酮酸还原酶上清液用量以酮酸还原酶酶活计为800U/mL缓冲液，所述葡萄糖脱氢酶上清液用量以葡萄糖脱氢酶酶活计为800U/mL缓冲液，所述葡萄糖用量以缓冲液体积计为200～800mM，所述底物用量以缓冲液体积计为100～400mM，NAD⁺用量以缓冲液体积计为0.5mM。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：以含酮酸还原酶、2-羟酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋芳香2-羟酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH6.0～8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～45℃、700rpm条件下反应完全后，得到含有光学纯芳香(R)-2-羟酸的转化液。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述外消旋芳香2-羟酸为下列之一：扁桃酸、2-氟扁桃酸、4-氟扁桃酸、2,4-二氟扁桃酸、3,5-二氟扁桃酸、2-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸、4-氯扁桃酸、2-溴扁桃酸、3-溴扁桃酸、4-溴扁桃酸、4-甲基扁桃酸、4-三氟甲基扁桃酸、3-羟基扁桃酸、4-羟基扁桃酸、4-甲氧基扁桃酸、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸、3-羟基-4-甲基扁桃酸、3-羟基-4-三氟甲基扁桃酸、3-甲基-4-甲氧基扁桃酸。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度为20-300mM，所述辅底物浓度为10-300mM，所述催化剂用量以湿菌体干重计为4-20g/L。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述工程菌是将酮酸还原酶、2-羟酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的编码基因共同导入宿主菌构建而成；所述2-羟酸脱氢酶的编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含酮酸还原酶、2-羟酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌接种到含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养8～10h，获得种子液；将种子液按体积浓度2％的接种量接入含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀达到0.4～0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，于28℃、150rpm条件下振荡培养10～12h，离心收集湿菌体并用生理盐水洗涤两次，即得湿菌体。