[发明专利]一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用

说明书

本发明公开了一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用。该纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明所公开的纳米抗体可以应用于杀螟硫磷与甲基对硫磷残留的实际样品检测，该纳米抗体具有较高的热稳定性、较高的有机耐受性及耐弱酸性等特点，可提高杀螟硫磷与甲基对硫磷免疫检测的灵敏度，且操作简单、所耗时间较短。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的筛选和制备，具有很高的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用。

背景技术

杀螟硫磷(Fenitrothion)又称杀螟松，是一种广泛使用的有机磷农药。杀螟硫磷具有较好的触杀与胃毒作用，可防治半翅目、鞘翅目等害虫，常用于玉米、水稻、大豆及蔬菜上的害虫防治。杀螟硫磷具有中等毒性，不合理施用杀螟硫磷会导致杀螟硫磷在作物上残留积累，过量摄入对人畜具有一定毒害作用：导致神经系统中的单键积累，引发恶心、呕吐、腹痛、腹泻、昏迷等症状，急性中毒还可危及生命。

对农作物中残留的杀螟硫磷进行准确检测是避免杀螟硫磷对人畜健康造成损伤的重要手段。目前国家标准中对杀螟硫磷的检测方法仍为仪器分析方法，如色谱与质谱联用的检测方法等。此类检测方法灵敏度和准确度高，但是需要昂贵的设备和试剂以及专业的操作人员，此外还需要经过复杂的制样过程，其耗费的时间和成本远远无法满足目前市场对大量农产品进行筛查的需要。

免疫分析方法是近年来发展起来的一种基于抗体特异性识别抗原分子并通过信号分子释放出的信号强度反映待测物含量的分析方法。免疫分析方法的特点是能够特异性的识别一种或一类目标分析物，灵敏度高，相较仪器分析方法而言所需设备简单，对操作人员专业要求低，检测时间短，有的免疫分析方法甚至能够在几分钟内对待测样品进行半定量或定量分析。常用的免疫分析方法有酶联免疫分析法、侧流免疫分析法、荧光免疫分析法、电化学免疫分析法等。免疫分析方法成功的关键在于制备灵敏度高特异性强的抗体。由于抗体的本质是蛋白质，因此免疫分析法必须在温和的条件下(合适的浓度的盐离子溶液、接近37℃的环境、偏中性的pH值、低浓度的有机溶剂等)进行，且需要避免免疫制剂在保存和运输过程中失活，影响其检测活性。

纳米抗体是一种新型的抗体制剂。1993年比利时科学家在羊驼科动物身上发现了天然缺失轻链的重链抗体。后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，这种单个结构域的重链抗体片段是目前人们通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其分子量大小只有15kD左右，仅为传统抗体的十分之一左右，其尺寸处于纳米级别，故又称为“纳米抗体”。

在纳米抗体应用的过程中，人们发现了纳米抗体具有一些有别于传统抗体的性质，其中最典型的是纳米抗体能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质可以使样品前处理过程得到一定简化，使得免疫分析法更加能满足市场对快检的需求。

中国专利：杀螟硫磷半抗原、人工抗原、特异性抗体及其用途 (CN101012239B)中提供了一种利用人工杀螟硫磷抗体，通过间接ELISA法、直接ELISA法用于检测杀螟硫磷的技术方案。由该中国专利的说明书可知，该专利在通过间接ELISA法检测杀螟硫磷时，IC₅₀＝13μg/L，说明目前针对杀螟硫磷的超高灵敏度的检测方法还未被提供。并且现有技术中也未提供过同时检测杀螟硫磷和甲基对硫磷的高特异性、灵敏度的检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种杀螟硫磷与甲基对硫磷的纳米抗体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种抗杀螟硫磷与甲基对硫磷的纳米抗体sm5。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述纳米抗体sm5的基因。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。