[发明专利]一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测试剂盒，包括以下组分：

（1）磁珠-适配体-互补链复合物，其制备方法包括：将链霉亲和素化的磁珠与生物素化的适配体相结合，振荡孵育，得到磁珠-适配体复合物；向磁珠-适配体复合物中加入互补链，振荡孵育，得到磁珠-适配体-互补链复合物；

所述适配体的核苷酸序列为5’-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’（SEQ ID NO：1）；

所述互补链的核苷酸序列为5’-AACCTAAGCATCTCGAGT-3’（SEQ ID NO：2）；

（2）AuNPs四面体，其制备方法包括：将修饰了DNA四面体链的AuNPs两两混合，在缓慢降温过程中形成DNA二聚体，之后将二聚体混合，震荡孵育形成DNA四聚体；

所述DNA四面体链分别为：

DNA1: 5’-TTTGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCCTTTTTTTTTTTTATTCAGATTCAGGACAGT-3’（SEQ ID NO：3）

DNA2: 5’-TTTCGCGCACCTGAGACCTTCTAATAGGGTTTGCGACAGTCGTTCAACTAGAATGCCCTTTGGGCTGTTCCGGGTGTGGCTCGTCGG-3’（SEQ ID NO：4）

DNA3: 5’-TTTGGCCGAGGACTCCTGCTCCGCTGCGGTTTGGCGAACTGGTCCCGTCTACTTACCGTTTCCGACGAGCCACACCCGGAACAGCCC-3’（SEQ ID NO：5）

DNA4: 5’-TTTGCCGTAATGTGCATGTATCTCCAGGCTTTCCGCAGCGGAGCAGGAGTCCTCGGCCTTTGGGCATTCTAGTTGAACGACTGTCGC-3’（SEQ ID NO：6）

所述修饰了DNA四面体链的AuNPs的制备方法包括：在单链DNA中加入TCEP溶液，以实现对巯基的活化，然后向该反应体系中加入金纳米粒子，震荡孵育，得到DNA-AuNPs复合物；

（3）滚环扩增模板，其制备方法包括：在T4 DNA连接酶的作用下，使滚环链和靶链形成闭合的滚环模板链；加入核酸外切酶，移除未结合的DNA链，形成具有进行扩增反应功能的滚环模板链；

所述靶链的核苷酸序列为5’-AATACTGAACAAAAAGCTATTATT TT-3’（SEQ ID NO：7）；

所述滚环链的核苷酸序列为5’- P-CTTTTTGTTCAGTATTCAGA TTCAGGACAGTGGGTGGAACTCGAGATGCTTAGGTTAATATCAAAAAATAATAG-3’（SEQ ID NO：8）。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，修饰了DNA四面体链的AuNPs的制备方法包括：将2-3 μL、0.4-0.6 M的三(2-羧乙基)膦溶液加入80-120 μL、8-12 μM的DNA单链中，震荡孵育20-40 min，活化巯基；向活化了巯基后的DNA中加入600-800 μL、粒径为2-4 nm的AuNPs溶液，孵育1-3 h，并在24 h内，分四次向混合液中加入NaCl溶液，直至NaCl的终浓度为45-55 mM；然后将样品以12000-13000 rpm离心8-12 min，除去溶液中未偶联的DNA链，除去上清液，重复三次；最终的沉淀重悬于1×TBE缓冲液中。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，AuNPs四面体的制备方法包括：将带有互补单链DNA的两个DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，40-60 nM NaCl中，将混合物放置于水浴锅中，在85-95℃中加热4-6 min，并在水浴锅中缓慢冷却至室温；高温使长链DNA变性，而随着缓慢降温的过程，DNA发生互补配对过程，并逐渐形成预期结构；将两个形成预期结构的DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，40-60 nM NaCl中，室温下震荡孵育24 h，分别在转速8000、6000、5000 rpm离心10 min，除去上清液，重复三次，最终重悬于1×TBE缓冲液中，即得到所需的金四面体。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，滚环扩增模板的制备方法包括：取150-250 μL的离心管，向其中加入0.8-1.2 μL滚环链、3 μL靶链、0.8-1.2μL T4 DNA连接酶缓冲液，4-6μL dd水；震荡2-4 min，离心0.8-1.2 min；在95℃下孵育4-6 min，55-65℃下孵育40-60min；然后加入0.8-1.2 μL T4 DNA连接酶，震荡混合，离心0.8-1.2 min，并在15-18℃孵育1-3 h，60-70℃下孵育8-12 min以灭活T4 DNA连接酶，终止反应；向上述反应体系中加入1-3 μL核酸外切酶 I、1-3 μL核酸外切酶 III、1-3 μL核酸外切酶I缓冲液、1-3 μL核酸外切酶III缓冲液、以及1-3 μL dd水，震荡混匀，离心0.8-1.2 min；在37℃下孵育30-50 min，并在70-90℃下孵育4-6 min灭活酶活性，终止反应。