[发明专利](R)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体及其在制备(R)-γ/δ-内酯中的应用

说明书

本发明涉及(R)‑5‑羰基癸酸(酯)还原酶突变体及其在制备(R)‑γ/δ‑内酯中的应用。具体公开了活性、稳定性和对映选择性提高的(R)‑5‑羰基癸酸(酯)还原酶突变体，其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化子，以及利用所述(R)‑5‑羰基癸酸(酯)还原酶突变体作为催化剂用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原，特别是催化羰基位于γ和δ位的长链脂肪族酮酸(酯)不对称还原以制备光学纯的香料化合物(R)‑γ/δ‑内酯的应用。与现有技术相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种催化性能明显提高的(R)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该(R)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物，制备光学纯的羟基酸，特别是催化羰基位于γ和δ位的长链脂肪族酮酸(酯)不对称还原以制备光学纯的香料化合物(R)-γ/δ-内酯的应用。

背景技术

香料是精细化学品的重要组成部分，广泛用于食品和日化产品中，它具有巨大的消费市场。许多内酯化合物由于具有香味，在香料中被广泛使用，例如γ-内酯和δ-内酯，即羟基酸的4-位或5-位上的羟基与链端的羧基脱水形成的内酯，它们具有天然的奶油和水果香味，如：(R)-γ-癸内酯具有出桃子、杏子和草莓的香气，(R)-δ-癸内酯具有椰奶香味，是内酯中主要的合成香料。其中，绝大多数(R)-对映异构体芳香气味浓郁，是天然香料的主要有效成分，经济附加值高。另外，从γ-内酯和δ-内酯这两种化合物的特殊结构可以看出，它们还是重要的基础化学品，比如是合成一些聚合物有用的构建模块，同时也是某些重要天然活性物质的组成部分，比如昆虫的信息素、抗生素等。因此，合成高光学纯度的γ-内酯或δ-内酯具有重大的经济价值。

早期，香料内酯化合物主要从植物中提取获得，由于技术有限，以分离提取的方式获得的香料量非常少，所以香料的价格一直很昂贵。随着科学技术的发展以及对香料香精化合物的需求不断膨胀，发酵技术得到了快速发展和运用。1963年，Francke首次报道可以利用酿酒酵母和面包酵母细胞生成光学纯的γ-和δ-羟基酸(A.Francke,Nature,1963,197,384–385)。目前，工业上主要利用酵母属细胞进行发酵，利用细胞代谢途径将底物蓖麻油或蓖麻酸转化成所需要的内酯。在这些内酯化合物中，γ-癸内酯的代谢通路是第一个被发现的，也是通过生物技术手段实现产量最多的内酯化合物。An,Jung-Ung课题组以10-羟基硬脂酸或12-羟基硬脂酸为原料，通过Waltomyces lipofer细胞的β-氧化可分别得到51g/L的(R)-γ-十二内酯、28g/L的(R)-γ-癸内酯、12g/L的(R)-γ-丁内酯，此产率是目前最高的(Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:8265-8272)。但发酵法获得的γ-内酯也存在副产物多、产品光学纯度低等问题，而且γ-癸内酯和它的前体4-羟基癸酸都被证明对酵母具有毒害作用，所以，为了解决这一矛盾，使用各种方法来减少内酯对发酵菌株的毒害，比如使用耐毒性的酵母、使用吸附剂将内酯从发酵液中分离出来或者酵母细胞进行固定化来保护酵母细胞，但是产量依然低。故其工业应用尚待深入研究。