[发明专利]一种病原菌种的低温保藏方法

说明书

本发明涉及一种病原菌种的低温保藏方法，属于病原菌种保藏技术领域。本发明提供的用于低温保存耶尔森菌属的菌，包括如下步骤：将低温保护剂与菌悬液混合，震荡均匀后，在‑70℃～‑90℃进行保藏，其中，低温保护剂包括：甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2‑9)：(0.2‑0.9)：(0.5‑2)。因为在该病原菌种的低温保藏方法中，将单一的保护剂甘油、蔗糖、左旋肉碱进行混合后作为复合保护剂，且保藏效果明显优于单一的保护剂，所以，本发明提供的低温保护剂对低温保存鼠疫杆菌具有较高的存活率，同时本发明提供的病原菌种的低温保藏方法不仅可以降低体系的毒性，还具有较好的保藏效果，因此可以有效地保藏鼠疫杆菌。

技术领域

本发明属于病原菌种保藏技术领域，具体涉及一种病原菌种的低温保藏方法。

背景技术

微生物菌(毒)种保藏方法从总体上可分为四类：传代培养保藏法、干燥保藏法、冷冻干燥法和低温保藏法。低温保藏法是长期保存大多数微生物的可靠方法，冷冻保存后形态学和生理学特征更加稳定，不需要基础设施(除了-80℃冰箱或液氮(-196℃外))，因此在实验室研究中最为常用，该方法保藏时间长，适用范围广，生物信息变异率低。

鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis，简称鼠疫菌)是人间鼠疫和动物鼠疫的病原体，它的主要宿主是啮齿类哺乳动物，媒介为吸血昆虫。鼠疫杆菌可以较长时间以不同形式存在于土壤中，因此有关鼠疫菌在自然界和实验室条件下土壤中保存的研究较多。目前实验室保藏菌种应用较多的为半固体保藏，该方法保藏时间较短，需要周期性传代接种，菌种易变异，而实验室内低温保藏鼠疫杆菌的相关研究较少。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种病原菌种的低温保藏方法。

本发明提供了一种病原菌种的低温保藏方法，用于低温保存耶尔森菌属的菌，具有这样的特征，包括如下步骤：将低温保护剂与菌悬液混合，震荡均匀后，在-70℃～-90℃进行保藏，其中，低温保护剂包括：甘油、蔗糖、左旋肉碱以及PBS缓冲液，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(2-9)：(0.2-0.9)：(0.5-2)。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，低温保护剂与菌悬液的体积比为1：(0.5-2)，优选1：1。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征，取2mL冻存管，将低温保护剂与一定浓度的菌悬液各取0.8mL进行1：1等体积混合，震荡均匀后置于-80℃冰箱或液氮中保藏。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，菌悬液的浓度为10⁷cfu/mL-10⁹cfu/mL，优选10⁸cfu/mL。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱的摩尔比为(8-9)：(0.2-0.4)：(0.5-0.7)。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，甘油、蔗糖、左旋肉碱、PBS缓冲液的摩尔体积比为(2-9)mol：(0.2-0.9)mol：(0.5-2)mol：1L。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，耶尔森菌属的菌为鼠疫杆菌。

在本发明提供的病原菌种的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，低温保护剂的制备方法如下：将甘油溶于PBS缓冲液，灭菌后，得A溶液；将蔗糖溶于PBS缓冲液，灭菌后，得B溶液；将左旋肉碱溶于PBS缓冲液，灭菌后，得C溶液；将A溶液、B溶液、C溶液混合均匀，即得低温保护剂。