[发明专利]一种基因工程菌株及其制备和基于该菌株的抗体亲和力成熟的定向进化方法

权利要求书

1.一种基因工程菌株，其特征在于，所述菌株通过将突变质粒和筛选靶标质粒构建到改造菌株中得到；

所述突变质粒包括pEP-mcs-(GGGGS)2-F1,2-Flag，序列如SEQ ID NO.1所示；

所述筛选靶标质粒包括pLA230-mcs-(GGGGS)2-F3-6xHis，序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述改造菌株为敲除基因thyA和folA后的大肠杆菌JS200-ΔthyaΔfola。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述突变质粒的构建方法包括以下步骤：

A1、PCR扩增得到基因片段SEQ-mcs-(GGGGS)2-F1,2-Flag，序列如SEQ ID NO.3所示；

A2、将表达thyA的基因序列插入突变质粒pEP的NdeI酶切位点中，所得pEP-thya质粒采用Bsu36I单酶切位点进行酶切反应，得到酶切线性骨架质粒pEP-thya-Bsu36I；

A3、将步骤A1的基因片段与步骤A2的酶切线性骨架质粒进行重组反应，即得突变质粒。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述筛选靶标质粒的构建方法包括以下步骤：

B1、PCR扩增得到基因片段SEQ-mcs-(GGGGS)2-F3-6xHis，序列如SEQ ID NO.4所示；

B2、将筛选靶标质粒骨架pLA230采用AflIII和SacI两个酶切位点进行酶切反应，得到酶切线性骨架质粒pLA230-AflIII/SacI；

B3、将步骤B1的基因片段与步骤B2的酶切线性骨架质粒进行重组反应，即得筛选靶标质粒。

5.一种如权利要求1所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将突变质粒和筛选靶标质粒电转化到大肠杆菌JS200-ΔthyaΔfola中，采用无抗性LB培养基培养后，再涂布至LB-thymine-相应抗性固体平板上培养，即得基因工程菌株。

6.一种基于权利要求1所述的基因工程菌株在抗体亲和力成熟的定向进化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括采用权利要求1所述的基因工程菌株筛选获得与抗原具有高亲和力的突变抗体。

8.一种抗体亲和力成熟的定向进化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将抗原和抗体分别构建到权利要求1所述的基因工程菌株的突变质粒和筛选靶标质粒的mcs区；

S2、步骤S1得到的菌株在一定TMP压力条件下进行突变筛选；

S3、获得突变位点信息，然后克隆表达，即得到与抗原具有更高亲和力的突变抗体。

9.根据权利要求8所述的抗体亲和力成熟的定向进化方法，其特征在于，步骤S2中，所述突变筛选采用的培养基中添加胸腺嘧啶；所述突变筛选的方式包括液体培养条件的突变筛选，固体平板上的突变筛选，液体-固体平板上交替的突变筛选。