[发明专利]一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒

说明书

本发明属于蛋白检测领域，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒。该方法包括以下步骤：S1.制备线性聚丙烯酰胺‑DNA聚合物；S2.金纳米颗粒的合成和修饰；S3.微流控芯片的设计和组装；S4.DNA水凝胶的合成；S5.检测。本发明利用DNA水凝胶对目标物进行检测，稳定性好，反应特异性强，可以实现可视化检测。利用微流控芯片进行检测，实现了便携性定量检测的目的。

技术领域

本发明属于蛋白检测领域，具体地，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒。

背景技术

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是全球范围内引起死亡的常见原因。根据世卫组织统计，在2015年1790万死于心血管疾病的病例中，约有890万人死于缺血性心脏病，而急性心肌梗死是其主要病因，且呈年轻化趋势。因此对急性心肌梗死进行快速有效的诊断具有重要的临床意义。由于心肌梗死发病的突发性和不可预知性，迫切需要开发出可以在任何场合快速有效诊断的便携式检测手段。

检测体液中生物标志物的浓度是诊断急性心肌梗死的有效方法，具有较高的准确性和精密度。肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB，CKMB)作为心脏生物标志物的一种，具有较高的特异性和敏感性，其值的连续监测还可用于判断再梗死的发生。急性心肌梗死发生时，血液中CKMB浓度上升至正常值上限(20ng/mL，44kDa)的两倍以上。在心梗发生的第4-6小时，血液中CKMB的含量开始上升，第24小时到达峰值，此时，其浓度可达正常值的10倍，在48-72小时恢复至正常水平。目前，有多种免疫测定方法已经用于生物标志物的检测，包括表面等离子体共振、荧光、电化学。但是它们都需要高成本的设备和专业的技术人员，往往受限于实验室等特定的操作环境，使其临床应用受到一定的限制。因此对便携式CKMB检测方法的需要十分迫切。ELISA试剂盒可以满足便携的要求，已经广泛应用于CKMB的筛查，但该方法存在孵育时间长、洗涤步骤多、灵敏度低等缺点。因此，本领域对准确、便携且低成本的CKMB检测方法的需求仍然十分迫切。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种便携、定量可拓展的基于DNA水凝胶的微流控芯片检测方法，以实现对心肌梗死标志物肌酸激酶同工酶的即时检测(POCT)。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法，包括以下步骤：

(1)制备线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物：分别将丙烯酰胺与S1和S2混合，真空干燥后，加入过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液，然后进行聚合反应，得到PS1和PS2；

S1的核苷酸序列为：5’-Acrydite-AAAAAGGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)；

S2的核苷酸序列为：5’-Acrydite-AAAAACCCTAAAAGCATC-3’(SEQ ID NO：2)；

(2)金纳米颗粒的合成和修饰：将HAuCl₄水溶液在搅拌条件下加热煮沸，然后迅速加入新鲜制备的柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸，得到金纳米颗粒AuNPs；将BSA与AuNPs混合，震荡孵育，然后通过离心再悬浮，得到BSA-AuNPs；

(3)微流控芯片的设计和组装：使用Auto CAD软件绘制芯片图形，并据此制备微流控芯片，该芯片是使用软光刻技术由聚二甲基硅氧烷制成的，具有液体进样口，水凝胶加样区，检测区和液体通道；本发明微流控芯片可委托商购获得；

(4)DNA水凝胶的合成：将PS1和AuNPs混合，将所得混合物在60-70℃和800-1200rpm条件下孵育，然后加入PS2，再孵育震荡，以确保均匀混合；将体系冷却至20-30℃，恒温过夜，得到DNA水凝胶；

(5)检测：