[发明专利]一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法包括以下步骤：

步骤一，采用聚碳酸酯为主要材料进行试剂盒上壳体与下壳体的制备，所述下壳体为上端开口的半密封壳体，所述下壳体为下端开口且上端有两个开口的壳体；

步骤二，将底板粘贴在试剂盒下壳体内部的下端位置，并在底板上对样品滴加区与结果显示区对应的区域进行标记；所述样品滴加区与结果显示区与上壳体的两个开口相对应；

步骤三，进行聚酯膜的选择，并将选择得到的聚酯膜切割成规格为8～10mm宽、4～5cm长的长条；将切割好的长条作为反应试纸条，对反应试纸条的边缘进行修剪处理；

步骤四，将罗非鱼经3～5次免疫后，收集全血；在室温自然析出血清，离心分离取上清液得到血清；用PBS液稀释进行2～3倍稀释后，离心，进行血清IgM蛋白的分离，纯化，浓缩，得罗非鱼血清IgM；

步骤五，将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后，在小鼠皮下多点注射，进行小鼠免疫，重复免疫2～3次后，再次用罗非鱼IgM蛋白对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫；

步骤六，取加强免疫2～5天后的小鼠细胞，预热至30～40℃后，加入细胞融合剂和预热到35～40℃的DMEM培养基，离心，置于固体培养基中进行细胞培养融合；当细胞生长到孔底一半时，开始筛查，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株；

步骤七，选择使用NC膜作为胶体金免疫层析试纸条上质控线和检测线的承载体，所述质控线为C线，所述检测线为T线；将NC膜进行准确切割，得到胶体金免疫层析试纸条基体；

步骤八，将步骤六获取的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株包被至所述胶体金免疫层析试纸条基体的检测线上，将羊抗小鼠免疫球蛋白抗体包被至所述胶体金免疫层析试纸条基体的质控线上；

步骤九，进行胶体金溶液的配制，将包被抗体后的胶体金免疫层析试纸条基体置于胶体金溶液中浸泡2～5min，使用磷酸缓冲液进行稀释，后进行印膜、干燥，得到胶体金免疫层析试纸条；

步骤十，将胶体金免疫层析试纸条置于壳体中，得到可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒。

2.如权利要求1所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述离心的方法为：将含有小鼠细胞、细胞融合剂和DMEM培养基的混合物置于800～1200rpm的离心机中离心15～20min。

3.如权利要求1所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤八中，所述抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株的包被浓度为0.5～0.8mg/mL。

4.如权利要求1所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤八中，所述羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的包被浓度为1.0～2.0mg/mL。

5.如权利要求1所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤十中，所述将胶体金免疫层析试纸条置于壳体，包括：

(1)确定样品滴加区与结果显示区的相对位置，按照确定的相对位置进行胶体金免疫层析试纸条的摆放；

(2)将摆放好的胶体金免疫层析试纸条与底板的样品滴加区与结果显示区相对应，并将其覆盖在底板上；

(3)对底板与胶体金免疫层析试纸条连接处进行压紧使其平整，并进行封闭胶水的制备；

(4)将上壳体与下壳体连接，使用封闭胶水进行连接处的涂擦，凝固得到可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒。

6.如权利要求5所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述按照确定的相对位置进行胶体金免疫层析试纸条的摆放，包括：将胶体金免疫层析试纸条按照样品滴加区在左，结果显示区在右，结果显示区内检测线在左，质控线在右的顺序进行摆放；或是将胶体金免疫层析试纸条按照样品滴加区在右，结果显示区在左，结果显示区内质控线在左，检测线在右的顺序进行摆放。