[发明专利]一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法

权利要求书

1.一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.外周血中B细胞的提取：取淋巴瘤患者外周血，加入羟乙基淀粉，外周血与羟乙基淀粉的体积比为4-5:1，室温放置1-2h，留取上清；取与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清加入到淋巴细胞分离液上，进行离心；取离心后中间的白膜层，洗涤并重悬；

S2.骨髓中B细胞的提取：取淋巴瘤患者骨髓，加入羟乙基淀粉，外周血与羟乙基淀粉的体积比为4-5:1，室温放置1-2h，留取上清；取与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清加入到淋巴细胞分离液上，进行离心；取离心后中间的白膜层，洗涤并重悬；

S3.肿瘤组织中淋巴瘤细胞的提取：取淋巴瘤患者肿瘤组织，加入胶原酶Ⅰ裂解，剪碎组织并在36℃-37℃孵育30-40分钟，边孵育边震荡；上清转移至含有10％血清的PBS中并反复冲刷组织；再将获得的上清过细胞筛并离心，收集细胞沉淀；洗涤细胞沉淀并重悬。

2.根据权利要求1所述的一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，其特征在于，步骤S1、S2和S3中，离心条件为23-30℃，1500-1800rpm离心10-15min。

3.根据权利要求1所述的一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，其特征在于，步骤S3中，震荡的条件为：200-250rpm/min。

4.根据权利要求1所述的一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，其特征在于，还包括对步骤S3得到的淋巴瘤细胞进行纯化；所述纯化方法为：每10⁷细胞加入90-100ul PBS混匀，加入10-15ul CD19微珠，混匀，4–8℃，静置15-20min；每10⁷细胞加入1-2ml PBS，1500rpm，4℃离心5min，弃上清，用PBS重悬；将LS柱子安装到磁铁上，加入3-5mlPBS，重力作用自然流尽；将细胞液加入到柱子中，用3-5mlPBS洗脱三次；利用LS柱子活塞推出结合在磁珠上的细胞，得到高纯化的CD19⁺淋巴瘤B细胞。

5.根据权利要求4所述的一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，其特征在于，还包括对步骤S1、S2得到的血细胞以及纯化后的淋巴瘤细胞进行冻存；所述冻存方法为：每5x10⁵-10⁶细胞加入1-1.5ml含有10％DMAO的血清冻存液中，混匀，-80℃过夜，隔天移入液氮中保存。