[发明专利]多聚嘧啶序列结合蛋白在制备脊髓损伤的修复药物中的应用

说明书

本发明公开了多聚嘧啶序列结合蛋白沉默剂联合维甲酸、嘌吗啡胺在制备脊髓损伤的修复药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明在体外通过病毒来沉默多聚嘧啶序列结合蛋白（PTB），同时联合添加与运动神经元分化相关的小分子维甲酸（RA）和嘌吗啡胺（PMA），成功使小鼠脊髓反应性星形胶质细胞重编程为运动神经元，为进一步体内研究PTB联合小分子的重编程策略在脊髓损伤后修复中的作用提供帮助，进而实现更好的脊髓损伤修复和功能重建效果。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及多聚嘧啶序列结合蛋白沉默剂联合维甲酸、嘌吗啡胺在制备脊髓损伤的修复药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种致残率高且后果严重的中枢神经系统损伤性疾病，严重损害患者运动功能，往往导致损伤部位以下的瘫痪。目前公认的SCI治疗有三大难点：一是迅速活化的反应性胶质细胞，尤其是星形胶质细胞会大量增生形成致密的胶质疤痕组织，使本身生长相对缓慢的轴突在延伸穿越损伤处时，遇到难以逾越的机械屏障及其分泌的抑制因子形成的化学屏障；二是部分受损的神经元会因坏死或凋亡而丢失，仅靠残留的少量神经干细胞无法足量补充丢失的神经元，而未丢失的受损神经元自身的再生能力也很有限；三是在损伤处会出现多种抑制再生因子和炎症因子，形成不利轴突再生的化学微环境。这些不利因素相互协调，最终导致SCI难以组织修复和功能重建。

神经组织损伤时，星形胶质细胞会大量反应性增生并表现出祖细胞特性，说明其在细胞转分化方面具有高度的可塑性。如果设法将SCI后大量增殖并带有负面影响的反应性星形胶质细胞作为靶细胞原位直接诱导重编程为神经元，甚至是具有相应功能的运动神经元，达到既能适当消除胶质疤痕，又能原位补充因SCI丢失的神经元的目的，同时改善轴突再生的微环境，应该是个一举多得的解决SCI后影响修复再生难点的好方法，并为SCI细胞替换治疗和个性化医药研发设想贡献了新的实现途径。

发明内容

PTB是一种RNA结合蛋白且在神经元的诱导和分化中扮演重要角色，目前有研究发现通过沉默PTB可以将星形胶质细胞重编程为有功能的神经元，并促进相应疾病模型小鼠的功能恢复。脊髓损伤是一种常见且治疗困难的神经创伤，脊髓损伤后星形胶质细胞发生反应性增生并在损伤处形成胶质疤痕，进而抑制神经元和轴突的再生；同时运动神经元大量丢失，受损神经元再生能力有限，这些都给脊髓损伤后修复带来了巨大难度。

本发明的目的是提供多聚嘧啶序列结合蛋白沉默剂联合维甲酸、嘌吗啡胺在制备脊髓损伤的修复药物中的应用。

在本发明中，所述多聚嘧啶序列结合蛋白沉默剂选用的是由慢病毒包装的shRNA-PTB（5’-GGGTGAAGATCCTGTTCAATA-3’）。

另一方面，本发明还提供了一种体外诱导脊髓反应性星形胶质细胞向运动神经元分化的方法，该方法是先通过病毒沉默多聚嘧啶序列结合蛋白，然后采用维甲酸和嘌吗啡胺促进分化。

本发明在体外通过病毒来沉默多聚嘧啶序列结合蛋白（PTB），同时联合添加与运动神经元分化相关的小分子维甲酸（RA）和嘌吗啡胺（PMA），成功使小鼠脊髓反应性星形胶质细胞重编程为运动神经元，为进一步体内研究PTB联合小分子的重编程策略在脊髓损伤后修复中的作用提供帮助，进而实现更好的脊髓损伤修复和功能重建效果。

附图说明

图1为原代小鼠脊髓反应性星形胶质细胞模型的建立结果。A为原代小鼠脊髓星形胶质细胞的GFAP染色；10 μg/mL LPS处理小鼠脊髓星形胶质细胞24 h后GFAP的mRNA水平（B）和蛋白水平（C）相较于control组明显升高。scale bar: 200 μm。

图2为shRNA-PTB慢病毒感染小鼠脊髓反应性星形胶质细胞沉默PTB的效率结果。shRNA-PTB慢病毒感染细胞2 d后PTB的蛋白（A）和mRNA（B）水平明显降低。shRNA-PTB慢病毒（C）感染细胞2 d后的荧光显微镜图。scale bar: 200 μm。