[发明专利]基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

构建RNA疫苗体外表达载体，并经质粒线性化、体外转录后得到RNA疫苗；

基于采集的PBMC获得T细胞和RNA疫苗修饰的DC细胞；

将RNA疫苗修饰的DC细胞和T细胞扩增培养，得到基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞。

2.根据权利要求1所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述构建RNA疫苗体外表达载体，并经质粒线性化、体外转录后得到RNA疫苗的步骤中，所述表达载体为pcDNA^TM6、pcDNA^TM5、pCEP4、pcDNA3.1的任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pcDNA3.1。

4.根据权利要求1所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述基于采集的PBMC获得T细胞和RNA疫苗修饰的DC细胞的步骤中，所述RNA疫苗采用电转的方式进入DC细胞得到RNA疫苗修饰的DC细胞。

5.根据权利要求1所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述将RNA疫苗修饰的DC细胞和T细胞扩增培养，得到基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的步骤中，所述RNA疫苗修饰的DC细胞和T细胞按照一定的比例先进行共孵育，然后进行扩增培养，所述扩增培养的扩增模式为OKT3/抗-CD28/IL-2、OKT3/IL-2、OKT3/IL-2/IL-7的任意一种。

6.根据权利要求5所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述扩增培养的扩增模式为OKT3/IL-2/IL-7。

7.根据权利要求5所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述共孵育的步骤中，所述RNA疫苗修饰的DC细胞和T细胞的比例为1：(3～10)。

8.根据权利要求1至7任一所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

在室温下，取PCR管，并向PCR管中加入质粒线性化试剂，温浴进行质粒线性化，线性化的质粒经PCR纯化试剂盒进行纯化回收，将纯化回收的线性化质粒和体外转录所需试剂制成一定体积的体系，温浴进行体外转录RNA，将体外转录好的RNA使用RNA纯化试剂盒进行纯化回收，得到RNA疫苗；

单采机采集哺乳动物的PBMC，采用Ficoll-Histopaque分离PBMC，贴壁一定时间，将T细胞冻存备用，DC细胞加入DC培养液，吸取DC培养液的上清液，经离心去除一半体积的培养基，加入相应体积的新鲜培养基、细胞因子和诱导试剂，诱导DC细胞成熟，收集诱导成熟的DC细胞，用RNA电转DC细胞，获得RNA疫苗修饰的DC细胞；

复苏冻存备用的T细胞，将RNA疫苗修饰的DC细胞洗涤并按比例加入到T细胞中，得到第一细胞混合液，将第一细胞混合液放入含有IL-2和IL-7的培养袋中诱导培养，诱导培养后的第一细胞混合液按比例加入到T细胞中，得到第二细胞混合液，将第二细胞混合液放入含有IL-2、IL-7和OKT3的培养袋中二次诱导培养，将第二诱导培养后的第二细胞混合液再加入T细胞，得到第三细胞混合液，将第三细胞混合液放入含有IL-2和IL-7的培养袋中进行第三次诱导培养，获得基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞。

9.一种如权利要求1至8任一所述的一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法制备的抗原反应性T细胞。

10.一种如权利要求9所述抗原反应性T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。