[发明专利]一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法及其检测试剂盒和应用

说明书

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法及其检测试剂盒和应用。本发明的总钴胺素和氰钴胺的检测方法包括总钴胺素的检测和氰钴胺的检测，所述总钴胺素的检测包括：将待测样品进行衍生处理，再采用液相色谱串联质谱法进行检测，所述衍生处理采用的衍生剂包括第一衍生剂和第二衍生剂，所述第一衍生剂为含有1‑5g/L氰化钠或氰化钾以及10‑100g/L氢氧化钠的水溶液；所述第二衍生剂为1‑10g/L的二硫代苏糖醇水溶液，pH为2‑9。该方法用样量少，检测速度快，且具有较高的准确度和精密度，可显著提高总钴胺素和氰钴胺检测的准确性和有效性，为各种钴胺素的含量测定提供了有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法及其检测试剂盒和应用。

背景技术

维生素B12(vitamin B12)又称钴胺素(cobalamin)、氰钴胺素，其分子结构(图1)是以钴离子为中心的咕啉环和5,6-二甲基苯并咪唑为碱基组成的多环化合物。因中央钴分子上结合的基团(图1中的“R”：5-脱氧腺苷、甲基、羟基、氰根离子)不同，维生素B12有多种活性形式，包括腺苷钴胺、甲钴胺、羟钴胺、氰钴胺。在人体内，腺苷钴胺和甲钴胺可作为人体中酶的辅因子，腺苷钴胺是甲基丙二酰辅酶A的辅酶，参与甲基丙二酸辅酶A向琥珀酰辅酶A的转化。甲钴胺是甲硫氨酸合成酶的辅酶，参与甲硫氨酸与同型半胱氨酸的代谢。在体外血中腺苷钴胺和甲钴胺含量很低，主要存在于细胞内，羟钴胺和氰钴胺则可存在于离心后血清或血浆中。

目前已有的检测样品中维生素B12的方法大部分基于免疫学方法(同位素放射免疫法，电化学发光免疫法，化学发光免疫法，荧光免疫分析法等)等。在临床最为常用的方法是采用化学发光原理的免疫学方法，其检测方便、快速、通量较高，然而，基于抗原抗体反应原理的免疫学方法可能存在着潜在的交叉干扰，譬如内因子抗体阳性时，可能干扰维生素B12的测定，使得维生素B12假性升高。

LC-MS/MS方法作为小分子代谢物的参考方法可为维生素B12的准确测定提供潜在的有力工具，然而目前LC-MS/MS方法对维生素B12营养的评估多为测定其代谢物-甲基丙二酸来间接反映维生素B12营养水平。另外，已报道的LC-MS/MS测定维生素B12多为测定钴胺素中的一种，如氰钴胺(D'Ulivo L，et al.Determination of cyanocobalamin byisotope dilution LC-MS/MS.Anal Chim Acta.2017Oct 16；990:103-109.)，无法真实反映维生素B12的总含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法，该方法可检测样品中的总钴胺素含量，还可检测样品中的氰钴胺含量，并根据两者确定其他维生素B12的活性形式的含量。本发明还提供基于该检测方法的检测试剂盒及其应用。

本发明的检测方法为基于液相色谱串联质谱检测技术建立，通过衍生化前处理方法，定量血液等样本中不同形式钴胺素(维生素B12)的总含量(总钴胺素)以及氰钴胺的含量。其中，总钴胺素的测定方法为基于以下构思建立：根据不同钴胺素的结构差异，采用衍生化方法，使不同形式的钴胺素均衍生为其最稳定的氰钴胺形式，而后进行样本提取，再在液相色谱质谱仪器上结合氰钴胺的分子量，其在质谱中产生特异的质量/电荷比(质荷比)以及在色谱中的极性，采用同位素内标法实现对总钴胺素的定量。氰钴胺的测定方法为基于以下构思建立：氰钴胺在体外较为稳定，因此不经过衍生，在液相色谱质谱仪器上结合氰钴胺的分子量，其在质谱中产生特异的质量/电荷比(质荷比)以及在色谱中的极性，采用同位素内标法实现对氰钴胺的定量。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法，该方法包括总钴胺素的检测和氰钴胺的检测，所述总钴胺素的检测包括：将待测样品进行衍生处理，再采用液相色谱串联质谱法进行检测，

所述衍生处理采用的衍生剂包括第一衍生剂和第二衍生剂，