[发明专利]一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法

说明书

本发明公开了一种利用高密度CHO‑S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，包括以下步骤：S1：首先从液氮中取出装CHO‑S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；S2：将CHO‑S细胞离心管完全解冻后，再用70％乙醇清洁CHO‑S细胞离心管的外壁，随后将CHO‑S细胞离心管内全部内容物倒入装有30ml预热的CHO‑S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数。本发明利用CHO‑S高密度无血清培养的方法表达和制备双特特异性抗体优化，通过对转染细胞使用的抗体重链和轻链质粒进行质粒提取、去内毒素、浓度定量和轻重配比的方法优化，从而获得获得更高的表达产物。

技术领域

本发明涉及一种退热药浴包，具体是一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法。

背景技术

哺乳动物细胞具有和人类相似的复杂翻译后修饰，常被用来表达具有活性的生物大分子蛋白，而这些生物大分子的功能发挥在一定程度上依赖于这些翻译后修饰。3T3，BHK，293，CHO，NS0，Hela等细胞均被研究并用作生物大分子蛋白的表达，但是有近70％已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的，CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。

现有的CHO-S细胞在进行制备时，补液条件较为苛刻，同时培养时间也较长。因此，一种能对传染后细胞的补液条件进行优化，能对培养时间进行优化，还能对纯化条件进行优化，并可以获得更高表达产物的制备双因子抗体方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

包括以下步骤：

S1：首先从液氮中取出装CHO-S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；

S2：将CHO-S细胞离心管完全解冻后，再用70％-75％乙醇清洁 CHO-S细胞离心管的外壁，随后将CHO-S细胞离心管内全部内容物倒入装有30ml预热的CHO-S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；

S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数；

S4：当培养浓度不超过5×106个活细胞/ml时，转移细胞悬液到更大体积的一次性无菌锥形瓶中，并放置到细胞培培养箱内继续培养，在CHO-S培养基通过两次以上不间断对数生长的细胞培养后即可进行下一步骤；

S5：活细胞密度达到1.0×106细胞/ml且细胞活力≥96％的范围内，最终用于可用于抗体基因的转染，完成转染细胞准备；

S6：使用质粒大提试剂盒，提取DNA，并向过滤后的细菌裂解液中加入除内毒素溶液增加1倍，达到到5ml，冰上孵育时间增加1倍，到60min，直到处理上清澄清；

S7：随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的DNA进行内毒素检测，确认抗体重链和轻链的质粒DNA内毒素较低时，即可进行下一步骤；

S8：对提取的抗体重链和轻链的质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％；

S9：按照抗体DNA重链和轻链用量2:3比例混合与OPT培养基中，并且等量OPT培养基稀释转染试剂后，将转染试剂DNA混合，轻轻混合均匀再加入CHO细胞中混匀，并放回摇床培养进行进行CHO-S细胞的转染。

优选的，所述S3中的细胞培培养箱的CO2含量为为8％，所述S3 中的细胞培培养箱的温度为37℃，所述S3中的细胞培培养箱的转数为130rpm。