[发明专利]一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法

权利要求书

1.一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备PM2.5储备液；

S2：将A549细胞在DMEM完全培养基中进行传代培养；

S3：对步骤S2中的细胞进行常规处理后，将细胞分为三组，分别标记为：处理组1，即不加入硒代蛋氨酸处理组；处理组2，即加入硒代蛋氨酸预处理组，预处理时间为9-12h；处理组3，即硒代蛋氨酸与PM2.5工作液混合处理组；

S4：待步骤S3中的三组细胞生长至对数生长期后，弃去所述步骤S3中处理组2各孔的培养基，加入含有硒代蛋氨酸的DMEM培养基；弃去步骤S3中处理组1和处理组3各孔培养基，加入DMEM完全培养基；

S5：待步骤S4进行9-12h后，弃去步骤S4中处理组1、处理组2和处理组3各孔的培养基后，分别向处理组1和处理组2加入含有不同浓度PM2.5工作液的DMEM完全培养基，向处理组3加入含有硒代蛋氨酸和不同浓度PM2.5工作液的DMEM培养基；

S6：待步骤S5中各组染毒结束后，检测细胞增殖活性，计算细胞存活率。

2.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S1中PM2.5储备液的制备过程是利用PM2.5采样器将PM2.5收集到聚丙烯纤维滤膜上，将载有细颗粒物的滤膜剪成1cm²大小，然后将其在DMSO中浸泡30min，涡旋5min，超声30min。

3.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S2、S4、S5中的DMEM培养基含10％胎牛血清、1×10²U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。

4.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S2中传代培养的条件为37℃，5％CO₂。

5.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S3中常规处理的方法为：待步骤S2中细胞生长达到90％满度，弃去步骤S2中培养基，加入胰酶消化液收集细胞并计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释。

6.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S4、S5中硒代蛋氨酸的浓度均采用20μM；所述步骤S5中PM2.5工作液均采用0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL三种浓度。

7.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S5中染毒时间为24-48h。

8.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S6中通过MTT比色法显色后计算细胞存活率，具体过程如下：待各组染毒结束后，弃去步骤S5中各孔的培养基，每孔依次加入含有MTT的培养基200μL，置于37℃培养箱中静置4h，弃去每孔培养基，依次加入DMSO 200μL，置于摇床上缓慢震荡，显色30min，然后每孔用移液枪取100μL上清液，转移至新孔板对应位置孔中，用酶标仪于490nm处测定吸光度，计算细胞存活率。

9.如权利要求1所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述步骤S6中细胞存活率计算公式为：

细胞存活率(％)＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％

As：实验孔(含处理细胞与DMSO)

Ac：对照孔(含未处理细胞与DMSO)

Ab：空白孔(仅含DMSO)

10.如权利要求8所述的一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，其特征在于，所述枪头包括依次联通的吸嘴区、容纳吸入液体的置液区、防止液体吸入移液枪的第一缓冲区、第二缓冲区、移液枪联通区，所述吸嘴区、置液区、第一缓冲区、第二缓冲区、移液枪联通区一体成型，所述吸嘴区前端设置有与针头过滤器连接的滤头接入端。