[发明专利]单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途

说明书

本发明公开了单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途。该方法包括：制备用于加热细胞的微米电极阵列芯片和温度传感器；获得二维材料导热层拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系；使细胞直接生成在绝缘导热层上；使二维材料导热层与细胞接触，通过微米电极阵列对细胞进行加热，并逐点测量目标细胞上方二维材料导热层的拉曼光谱信号，获得全场的拉曼光谱分布图；基于二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系和二维材料导热层中每一点的拉曼光谱特征峰的波数偏移量，获得目标细胞全场的温度分布。该方法能解决测量活体细胞全场温度分布的难题，加深对细胞生理行为的了解，促进疾病病理研究、药物研发等相关领域的进一步发展。

技术领域

本发明属于活体细胞生物特征测量领域，具体而言，涉及单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途。

背景技术

细胞是生物学中构成生物体基本的结构和功能单位，通过对细胞进行观测与实验分析不仅能够深入了解细胞内各项生理活动的进行过程，更有利于对各种疾病开展病理研究并促进药物研发、疾病诊疗等相关领域的发展。温度是影响细胞内各种生化反应(如能量转化、基因表达、分裂分化等)的极其重要的物理参数，因此人们对在单细胞尺度上进行无创精确的温度测量产生了浓厚的兴趣。由于单个细胞温度测量需要同时满足高温度分辨率、高时空分辨率、抗环境干扰能力强等多重要求，传统常规的测温方式如热电偶测温、红外热像仪测温空间分辨率低(目前可以达到的空间分辨率约10μm)，很难在细胞水平上得以应用。值得欣慰的是，随着微纳加工技术的发展，越来越多的亚微米高分辨率测温技术涌现出来。

目前已有的测量单个细胞温度的方法主要分为发光式细胞测温技术与非发光式细胞测温技术两大类。发光式测温技术可以通过荧光标记物的荧光发射强度、温度依赖性荧光寿命、量子点发光峰波长漂移等将细胞温度实时测量出来，例如Kohki等利用FPT荧光聚合物的荧光寿命作为温度相关的参数，辅以荧光寿命成像显微镜于2011年首次对外公布了单个细胞的温度图谱，该方法的空间分辨率为200nm，温度分辨率在0.18-0.58℃之间。非发光式细胞测温技术则包括了多种测温方法，如(1)扫描热显微镜：其在原子力显微镜(AFM：Atomic Force Microscope)悬臂梁探针尖端放置金属热电偶结，由于点接触结的热电动势仅依赖于接触点的局部温度，因此通过测量接触点的热电动势即可得到对应的温度，温度分辨率在0.01K左右，空间分辨率小于100nm；(2)碳纳米管温度计：在323-773K的温度范围内Ga(镓)的热膨胀系数呈线性和可重复性变化，故此法通过碳纳米管内一维纳米液体Ga(镓)的热膨胀来对温度进行测量；(3)基于生物实体的测温技术：活细胞能够感知生理生长范围内的温度变化和有害的温度上升或下降，并诱导所谓的冷休克或热休克蛋白，这样的温度感应是通过蛋白质或核酸的构象变化直接响应或者通过复杂的调节电路间接响应来实现的。

从现如今已有的测温方法来看，在发光式测温技术中，有机荧光团容易受到光漂白的破坏，导致无法进行连续长期的温度测量，这对跟踪不同时间尺度的温度变化非常不利；量子点测温技术的主要局限性表现为量子点材料不良的溶解性、不稳定性及对生物细胞的毒性，此外在连续照射条件下，量子点发光的蓝移、漂白、闪烁也会对结果造成影响；扫描热显微镜虽然具有亚微米的空间分辨率且能够采集全场的温度分布，但是接触式热电偶容易破坏细胞的完整性，测量过程中热电偶和柔性细胞膜也难以保证良好接触，此外细胞复杂的电场也会影响测温精度；基于生物实体的测温技术因其具有生物特异性与选择性，难以广泛用于一般细胞的温度测量。现有某些RNA温度计在真细菌中可以使用，但仍需要根据给定菌种的生长特性进行修正。

综上所述，现有的细胞测温方法存在诸多局限：易受环境影响、无法测量活体细胞、稳定性不强、缺乏普适性、无法进行全场测温等等，尚缺乏一种可以准确测量活体细胞温度分布的原位无损方法，制约了单细胞内在生理活动的深入研究。

发明内容