[发明专利]一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用，所述酿酒酵母工程菌在原始酿酒酵母中导入了携带ARO8基因的重组质粒。本发明通过构建过表达ARO8酿酒酵母基因的酿酒酵母工程菌，提高了菌体的细胞通透性，从而提升了生物被膜的产量，从而使酿酒酵母在发酵过程中乙醇产量提高，菌落数量和粘附性增加，提高了糖转化率和乙醇产率，缩短了发酵周期。本发明通过包埋法共固定化糖化酶制剂与酿酒酵母细胞，在菌体细胞膜通透性被处理的基础上，进一步提升了酿酒酵母ARO8基因过表达基因工程菌的生物膜产量和葡萄糖转化率，缩短了发酵周期并减少了耗糖量。

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体涉及一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

生物膜，又称生物被膜，是一种由微生物自发形成的固定在介质表面的多细胞群体，它的主要成分是微生物细胞和其分泌的胞外多聚物(EPS)，因为其能增加细胞群体的抗逆性，利于细胞群体生存而受到人们的关注。生物被膜的生长是一个非静止的过程，主要分为初始粘附期、不可逆固着期、生长期、成熟期和扩散期这五个时期。随着时间的增长胞外分泌物会与细胞群落形成相对稳定的结构，菌落的抗逆性得到了极大的增强。在酿酒酵母生产乙醇的发酵过程中，限制乙醇产量的重要因素之一就是底物和产物的耐受性，高浓度的糖和乙醇会对酵母产生毒害作用，影响细胞本身的正常生长和发酵。一般超过200g/L的糖就会对酿酒酵母细胞产生毒害作用，而通过固定化发酵却可以使酵母的葡萄糖耐性达到300g/L以上。固定化发酵也可以使酿酒酵母的连续化和发酵效率提高，常规游离发酵的8个h可以消耗50g/L的葡萄糖作为碳源，而固定化发酵的酿酒酵母消耗同样的葡萄糖仅需要6个h左右，并且随着发酵批次的增加，整个固定化发酵体系会进入一个相对稳定的状态，此时整个体系可以以4h的发酵周期稳定进行几十个批次的乙醇发酵。因此如何调节生物被膜在固定化发酵中的作用显得尤为重要。生物被膜已经被证明在发酵生产中有积极的作用，而生物被膜的多少、膜的厚度在微生物发酵中都是重要影响因素。生物被膜过多可能会导致细胞与营养物质接触困难、代谢废物堆积从而损害细胞自身影响发酵产率；而生物被膜过少则发酵优势不明显。

细胞膜的通透性是细胞膜的特性之一，可以帮助细胞保留或者排出某些物质，通过人为的方法处理细胞可以改变细胞膜的通透性，从而改变代谢产物的排出效率和细胞的物质交换。生物被膜的形成与细胞的物质交换和代谢息息相关，改变细胞膜的通透性可以在很大程度上提升生物被膜的产量。

包埋固定化是一种将酶与酶、酶与细胞、细胞与细胞同时固定在体内形成固定化系统的一种技术，是目前酿酒酵母中应用最广泛的一种固定化方法。包埋法主要分为天然载体类包埋法和有机合成类载体包埋法。天然载体类包埋法主要有琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙、卡拉胶、海藻酸钠及聚乙烯醇等。它们的特点是生物无毒，成型方便及固定化密度高，但机械强度低，传质能力弱，抗微生物分解能力较差。而有机合成类载体包埋法所采用的如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇虽化学性能稳定、机械强度高，但在固定化过程中聚合物形成条件剧烈，对细胞有损害作用。而且由于细胞被包埋在载体内部，所以也会存在着传质差、后期菌体死亡和催化效率低下的问题。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种酿酒酵母工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母工程菌的构建方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母工程菌的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种酿酒酵母工程菌，该菌株中的ARO8基因被过表达，即在原始酿酒酵母中导入了携带ARO8基因的重组质粒。

其中，过表达ARO8前，ARO8基因序列如SEQ ID NO：1所示，过表达后ARO8后，所述携带ARO8基因的重组质粒基因序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c。