[发明专利]一种利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法

权利要求书

1.一种利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，其特征在于，包括：

(1) 将成熟人参清洗消毒，切片，接种到不定根诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到不定根诱导培养基中继代培养扩繁；然后将扩繁获得的人参不定根接种到液体培养基中培养获得人参不定根；所述不定根诱导培养基的组成为1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激动素，0.2-1mg/L赤霉素，0.075-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基；

(2) 将步骤(1)制得的人参不定根取根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；

(3) 将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团，再将所述干细胞团转入干细胞继代培养基中暗培养；所述干细胞诱导培养基的组成为2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4 mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；

所述干细胞继代培养基的组成为2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4 g/LWPM培养基；

(4) 将步骤(3)继代培养的人参干细胞接种至干细胞液体培养基摇瓶中，以100-140rpm的条件避光培养；所述干细胞液体培养基的组成为2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L 蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4 g/LWPM培养基；

(5) 将步骤(4)摇瓶培养后的人参干细胞接种至生物反应装置中，避光培养，获得人参干细胞；

所述步骤(1)中所使用的液体培养基的组成为：10-55g/L蔗糖，0.6-1.6g/L B5培养基，0.3-1.2g/L 1/2MS培养基，1.8-5.4 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤，0.6-5.4 mg/L 萘乙酸， 0.8-8mg/L 赤霉素，0.6-5.4 mg/L吲哚乙酸，0.6-5.4 mg/L吲哚丁酸。

2.根据权利要求1所述利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基的组成为：15-45g/L蔗糖，0.8-1.3g/L B5培养基，0.5-1.0g/L 1/2MS培养基，1.8-4.2 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤，1.8-5.4mg/L 萘乙酸，0.8-8 mg/L 赤霉素，0.6-4.8 mg/L吲哚乙酸，0.6-3.6 mg/L吲哚丁酸。

3.根据权利要求2所述利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基的组成为：45g/L蔗糖，1.28g/L B5培养基，0.905g/L 1/2MS培养基，4.2 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤，3 mg/L 萘乙酸，0.8 mg/L 赤霉素，0.6 mg/L吲哚乙酸，0.6mg/L吲哚丁酸。

4.根据权利要求1-3任意一项所述利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(5)中，将干细胞接种到生物反应装置的干细胞液体培养基中时，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的1.0%-10.0%；在生物反应装置中进行培养干细胞的通气量为0.02-0.2vvm。

5.根据权利要求4所述利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，其特征在于，在生物反应装置中进行培养干细胞的通气量为0.05-0.15vvm。

6.根据权利要求1-3任意一项所述利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，其特征在于，生物反应装置包括罐体，所述罐体的底部包括至少两个进气装置。