[发明专利]一种利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法

说明书

本发明公开了一种利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法，包括：(1)采用一步法制备人参不定根；(2)将步骤(1)制得的人参不定根取根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；(3)将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团，再将所述干细胞团转入继代培养基中暗培养；(4)将步骤(3)继代培养的人参干细胞接种至干细胞液体培养基摇瓶中，以100‑140rpm的条件避光培养；(5)将步骤(4)摇瓶培养后的人参干细胞接种至生物反应装置中，避光培养，获得人参干细胞。采用本发明的液体培养基和培养方法，能够直接通过成熟人参的各个部分诱导产生不定根，在简化诱导步骤、缩短诱导时间的同时提高不定根中人参皂苷的含量，最终获取指标良好的人参干细胞。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一种利用生物反应装置的人参干细胞分离培养方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科人参属植物，分布于中国、日本、韩国，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参味甘、微苦，微温，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效，多用于体恤欲脱，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，惊悸失眠等。人参皂苷是人参主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生产等功效。近年来，人参被广泛地用在各类化妆品、保健品、饮品中，人参的市场前景非常广阔。

目前由于过度采挖、环境破坏等，野生人参资源几乎灭绝，大田栽培是人参的主要来源。然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，栽培技术复杂以及农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。大田栽培人参供应难以满足市场的需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产，具有很大的发展前景。

目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。

申请号为201410698528.0的中国专利公开了一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸。上述方案中，将日龄为28-32天的组培苗切成小块直接诱导不定根，组培苗幼嫩，分化能力强，且实际上需要先经过种子萌发或者外植体培养获得组培苗，仍然需要至少28-32天的时间，外植体培养仍然需要诱导愈伤组织。因此，实际上并没有缩短周期。

人参干细胞是未分化的细胞，具有无限分裂能力，目前可以通过分离与培养人参的干细胞来生产人参相关的药物活性成分。目前现有技术在分离人参干细胞时，均采用已经分化的组织器官为外植体，通过立体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤组织细胞。但这种细胞本质来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化生产中，容易出现细胞系退化，分裂能力弱。另外，培养周期长，得到的干细胞中有效成分含量也有待提高。

人参不定根根尖部分存在分生组织，分裂能力强。因此，倘若能够探索所需时间更短、步骤更简单的从成熟人参培养获得人参干细胞的方法，同时可以提高人参干细胞中有效成分的含量，则有利于临床应用，具有广泛的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容