[发明专利]一种肉鸭实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及应用

说明书

本发明属于动物基因工程技术领域，公开了一种肉鸭实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及应用。本发明利用肉鸭转录组数据库，选取八个候选内参基因，以八个候选内参基因序列为模板，设计实时荧光定量PCR特异引物，进行荧光定量PCR实验，最后运用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行数据分析，筛选出最稳定内参基因是HMBS和YWHAZ。本发明方法建立了肉鸭稳定的内参基因的筛选体系，为后续采用荧光定量PCR研究肉鸭基因表达的研究提供了稳定内参基因。

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，具体为一种肉鸭实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及应用。

背景技术

在动物遗传育种中，基因表达模式探究普遍且重要。实时荧光定量PCR是基因表达模式研究中最常用的核酸定量技术，它具有更高的灵敏度，更好的特异性和更宽的检测范围。初始样品量、RNA完整性、cDNA合成效率等可能存在的一些差异，会影响实时荧光定量PCR结果的准确性。因此，筛选合适的内参基因是实时荧光定量PCR的重要前提条件。

许多研究已经筛选出一些内参基因，如肌动蛋白(β-actin)，核糖体RNA(18S RNA)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，这些基因与基本细胞过程有关，如核糖体生物合成，糖酵解代谢，蛋白质折叠和细胞骨架构成等。然而，大量研究表明，没有一种内参基因可以满足在所有试验因素下都能恒定表达，因此选择错误的内参基因不仅起不到校正关键基因的目的，还会导致试验结果不准确。因此，筛选合适的内参基因是保证研究准确性的重要基础，有必要为特定动物物种筛选适合的内参基因。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种肉鸭实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及应用，筛选出最合适的内参基因，为以后大规模开展基因特性及功能研究奠定基础。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种肉鸭实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

(1)利用肉鸭转录组测序数据，挑选八个肉鸭内参候选基因，并以挑选的八个肉鸭内参候选基因的核苷酸序列为模板设计了八对实时荧光定量PCR的内参基因引物，八对实时荧光定量PCR的内参基因引物序列及扩增片段序列分别为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24，具体如下：

①肉鸭(Anas platyrhynchos)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，其实时荧光定量PCR的内参基因引物序列为：

正向引物GAPDH-F，如SEQ ID NO.1所示，具体的核苷酸序列为TGCCATCACAGCCACACAGA；

反向引物GAPDH-R，如SEQ ID NO.2所示，具体的核苷酸序列为ACACCCAAGGAAGGCCAACA；

扩增片段长度为166bp，序列如SEQ ID No.3所示，具体的核苷酸序列为：

TGCCATCACAGCCACACAGAAGACAGTGGATGGCCCCTCTGGGAAGCTGTGGAGGGATGGCAGAGGAGCTGCCCAGAACATTATCCCAGCCTCTACTGGGGCTGCTAAGGCTGTGGGAAAAGTCATCCCTGAGCTCAACGGGAAGCTTACCGGAATGGCTTTCCGT。

②肉鸭(Anas platyrhynchos)肌动蛋白(β-actin)，其实时荧光定量PCR的内参基因引物序列为：

正向引物β-actin-F，如SEQ ID NO.4所示，具体的核苷酸序列为GATGAATCCGGACCCTCCAT；

反向引物β-actin-R，如SEQ ID NO.5所示，具体的核苷酸序列为AAGGGTGTGGGTGTTGGTAA；