[发明专利]一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组及其试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测新型冠状病毒的多重重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，其特征在于：所述引物组包括用于扩增人ACTB基因的引物对和用于扩增新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因或E基因的引物对中的一种或多种；所述探针组包括用于扩增人ACTB基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、E基因的探针中的一种或多种；

所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示；所述用于扩增人ACTB基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；

所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:21；所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:16；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:45；所述用于检测人ACTB基因的探针核苷酸序列为SEQ ID NO:30。

2.根据权利要求1所述的引物组、探针组，其特征在于，所述探针组中的探针有四个修饰位点：在距5’端约30个碱基处、距3’端约15个碱基处使用四氢呋喃及其类似物替代原有碱基，作为核酸外切酶的识别位点；四氢呋喃及其类似物上游的T碱基上标记一个荧光基团，下游的T碱基上标记一个荧光基团对应的淬灭基团，两个基团之间的间距为2-4nt；在3’末端标记阻断探针延伸的阻断基团。

3.根据权利要求2所述的引物组、探针组，其特征在于，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3。

4.根据权利要求2所述的引物组、探针组，其特征在于，所述阻断基团包括C3-Spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。

5.根据权利要求1所述的引物组、探针组，其特征在于，所述引物组中N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的反向引物用抗原标签1标记，N基因、ORF1ab基因、E基因或人ACTB基因的正向引物分别用抗原标签2、3、4、5标记，所述抗原标签1与抗原标签2、3、4、5不相同。

6.根据权利要求5所述的引物组、探针组，其特征在于，所述抗原标签1包括生物素、FAM、CY5、TAMRA或地高辛。

7.一种用于检测新型冠状病毒的实时荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括溶解缓冲液、冻干酶粉、醋酸镁溶液、权利要求2～4任一项所述的引物组和探针组；所述溶解缓冲液包括30-50mM Tris缓冲液、50-150mM醋酸钾；所述冻干酶粉包括100-500ng/μL重组酶、100-400ng/μL重组酶辅因子、400-900ng/μL单链DNA结合蛋白、50-200ng/μL DNA聚合酶、100-500ng/μL核酸外切酶、50-100ng/μL逆转录酶、1-3mM ATP、30-100mM磷酸肌酸、200-300ng/μL肌酸激酶、200-500μM dNTPs、5％-10％w/v聚乙二醇20000、1-5mM二硫苏糖醇。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为：

1)配置反应体系：29.4μL溶解缓冲液，权利要求2～4任一项所述的引物组和探针组，所述引物组中各基因正向引物、反向引物的终浓度均为200-600nM；所述探针组中各探针的终浓度均为60-180nM，共50μL；

2)将配置好的反应体系加入冻干酶粉中，混匀，加入2.5μL 28mM醋酸镁溶液于管盖中，离心，实时荧光PCR扩增42℃反应20分钟。