[发明专利]一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法

权利要求书

1.一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用一步法培养人参不定根，包括：将成熟人参清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根

所述诱导培养基的组成为1-6mg/L萘乙酸，0.2-1mg/L赤霉素，0.1-0.6mg/L激动素，0.1-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基；

(2)取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；

(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；所述干细胞诱导培养基的组成为2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；

(4)继代培养：挑取部分(3)获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，暗培养；所述干细胞继代培养基的组成为2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；

(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，暗培养，获得干细胞；干细胞液体培养基的组成为2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；

(6)生物反应装置培养：将(5)获得的人参干细胞接种到含有干细胞液体培养基的生物反应装置中，暗培养，获得人参干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，在生物反应装置培养干细胞时，通气量为0.01-0.35vvm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，在生物反应装置培养干细胞时，通气量为0.05-0.2vvm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，将干细胞接种到生物反应装置的干细胞液体培养基中时，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的3.0％-8.0％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的4.0％-8.0％。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，生物反应装置包括罐体，罐体的底壁的高度由四周向中心逐渐降低，形成从上到下直径逐渐减小的倒锥形；出料口设置在中心最低的位置，至少两个进气装置围绕出料口间隔均匀分布在由四周向中心逐渐降低的底壁上。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，取(1)中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作以解剖刀切割获得根尖干细胞区域。

8.根据权利要求1-4任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，干细胞诱导培养基的组成为3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/LB5培养基。