[发明专利]一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1及其克隆与应用有效

申请号：	202110432421.1	申请日：	2021-04-21
公开（公告）号：	CN113512547B	公开（公告）日：	2023-05-02
发明（设计）人：	辛士超;顾晓川;吉努乌达亚巴努;华玉伟;戴雪梅;杨先锋;黄华孙	申请（专利权）人：	中国热带农业科学院橡胶研究所
主分类号：	C12N15/113	分类号：	C12N15/113;C12N15/10;C12N15/84;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/38
代理公司：	北京兴智翔达知识产权代理有限公司 11768	代理人：	郭卫芹
地址：	571101 海南***	国省代码：	海南;46
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摘要：
搜索关键词：	一种橡胶树基因启动子 prohbubi1 及其克隆应用
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【权利要求书】：

1.一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1，其特征在于，所述启动子proHbUBI1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1。

3.一种包含权利要求1所述的橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1的瞬时表达载体，其特征在于，所述瞬时表达载体为将权利要求1所述的橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1构建到表达载体pJIT163-hGFP中获得的重组质粒proHbUBI1-163hGFP。

4.一种包含权利要求1所述的橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1的稳定转化表达载体，其特征在于，所述稳定转化表达载体为将权利要求3所述瞬时表达载体proHbUBI1-163hGFP上的proHbUBI1::hGFP表达框构建到转化载体pCAMBIA3301上获得的重组质粒proHbUBI1-hGFP-pC3301。

5.一种克隆权利要求1所述橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以巴西橡胶树热研7-33-97叶片基因组DNA为模板，设计如下引物：

proHbUBI1-F：ATGCCTTACCTTTGGCAGTG；

proHbUBI1-R：CTGATCACAAAATAACAAAAC；

（2）使用KOD FX酶进行PCR扩增；

（3）将扩增产物TA克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Dh5α中并挑单克隆测序，即得。

6.一种构建权利要求3所述瞬时表达载体的方法，其特征在于，所述瞬时表达载体proHbUBI1-163hGFP的构建方法包括将权利要求1所述的橡胶树泛素基因启动子proHbUBI1构建到表达载体pJIT163-hGFP中，以替换掉该载体上的2×35S启动子的步骤，具体包括如下步骤：

（1）设计如下引物分别在proHbUBI1序列5’和3’端引入SacI和NcoI酶切位点，引物设计如下：

proHbUBI1-sF：AGCGAGCTCATGCCTTACCTTTGGCAGTG；

proHbUBI1-nR：ATGCCATGGCTGATCACAAAATAACAAAAC；

（2）同时用SacI和NcoI双酶切扩增得到的启动子片段和pJIT163-hGFP载体，分别回收1249bp 启动子proHbUBI1和3671bp载体骨架片段；

（2）使用T4 DNA连接酶将proHbUBI1启动子连接到pJIT163-hGFP载体的绿色荧光蛋白基因hGFP上游，即得所需重组质粒proHbUBI1-163hGFP。