[发明专利]一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法

权利要求书

1.一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建mCherry-2A-insulin-His融合基因慢病毒表达载体，

（2）将构建的mCherry-2A-insulin-His融合基因慢病毒表达载体在人间充质干细胞中进行表达，即可得到分泌到胞外的人胰岛素；

其中，步骤（1）中构建mCherry-2A-insulin-His融合基因慢病毒表达载体的方法为：以pLV[Exp]-Neo-TRE3GhINS[NM_001185097.1]/EK/10xHis为模板，以2A-insulinF和His-insulinR为引物进行PCR扩增，将扩增产物与慢病毒表达载体pLV-EF1α-mCherry-Puro双酶切后连接，获得表达mCherry-2A-insulin-His融合基因的慢病毒载体pLV-EF1α-mCherry-2A-insulin-His-puro，所述2A-insulinF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，His-insulinR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

步骤（2）中，将构建的mCherry-2A-insulin-His融合基因慢病毒表达载体在人间充质干细胞中进行表达的方法为：

（a）将慢病毒载体pLV-EF1α-mCherry-2A-insulin-His-puro和病毒包装辅助载体pH1和pH2共转染293T细胞；

（b）培养转染后的293T细胞，收集含病毒的培养基，离心收集含病毒上清液；

（c）培养人间充质干细胞，将步骤（b）得到的上清液加入到人间充质干细胞中进行感染，继续培养可得到分泌到胞外的人胰岛素。

2.根据权利要求1所述的一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：

1μL pLV[Exp]-Neo-TRE3GhINS[NM_001185097.1]/EK/10xHis载体，浓度1ng/μL

1μL 2A-insulinF 引物，浓度25μM

1μL His-InsulinR 引物，浓度25μM

25μL 2xPCR mastermix

22μL ddH₂O

反应体系共50μL；

所述PCR扩增的扩增程序为：

第一步：95℃ 3 min

第二步：95℃ 1 min；55℃ 20 sec；72℃ 1 min ，共35个循环

第三步: 72℃ 10 min。

3.根据权利要求1所述的一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法，其特征在于，将上清液加入到人间充质干细胞中进行感染的同时，需要添加聚凝胺并控制聚凝胺终浓度为10μg/mL。