[发明专利]叶酸中杂质6-甲酰蝶呤含量的检测方法

说明书

本发明提供了一种叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤含量的检测方法。该方法以Agi l entSB‑CN为色谱柱，在高效液相色谱(HPLC)分离后，采用荧光检测器对叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤进行定性和定量检测，并进行方法学验证。经实验验证，该方法能够实现对叶酸中微量的光敏杂质6‑甲酰蝶呤和蝶呤6‑羧酸的同步定量检测，该方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点。本发明首次建立了叶酸中微量光敏杂质6‑甲酰蝶呤和蝶呤6‑羧酸的同步定量检测方法，便于对叶酸进行质量控制，从而提高了叶酸原料药的质量和用药安全性。

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种叶酸中杂质6-甲酰蝶呤含量的检测方法。特别地，涉及一种叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法。

背景技术

叶酸是一种维生素的基本品种，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人体缺少叶酸可导致红细胞的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白细胞减少；孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。

叶酸极不稳定，易受紫外线、高温等影响而发生氧化。当暴露于紫外线辐射后，叶酸分子会裂解为对氨基苯甲酰基-L-谷氨酸(p-aminobenzoilglutamicacid,PABA-Glu)和6-甲酰蝶呤(6-formylpterin,FOP)，6-甲酰蝶呤在紫外线和氧气的作用下又会进一步转变为蝶呤6-羧酸(6-carboxypterin,CAP)，6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸反过来又会促进叶酸的光降解。此循环一旦开启，就会加速叶酸的光降解，使其杂质含量增加，使原料药质量下降，同时增加了用药安全性方面的安全隐患。

因此，对叶酸原料药中6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸杂质的含量进行监测非常重要。但是，由于6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸杂质在叶酸中的含量较低，因而采用常规高效液相色谱(HPLC)分离，结合紫外检测的方法无法检测。并且，6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的化学结构和理化性质接近，6-甲酰蝶呤在一定条件下还会向蝶呤6-羧酸转变，导致目前尚无能够将叶酸中的微量杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸分离，并实现对其同步定量检测的HPLC检测方法。因而，建立对叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，对于对叶酸进行质量控制，以提高叶酸原料药的质量和用药安全性具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，并进行了方法学验证。经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点，能够可靠地对叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检。

具体地，通过以下技术方案实现了本发明：

本发明提供了一种叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，将叶酸溶解后直接进样，采用HPLC分离结合荧光检测器对叶酸中6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸进行定性和定量检测，所述HPLC分离结合荧光检测器的色谱条件为：

色谱柱：AgilentSB-CN色谱柱；流速：0.8-1.2mL/min；柱温：33-37℃；流动相A：甲醇-含0.2％磷酸的水＝15：85-25：75；流动相B：甲醇-0.2％磷酸的水＝40：60-50：50；

梯度洗脱条件见下表1。

表1：梯度洗脱表