[发明专利]构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法

权利要求书

1.一种构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.构建用于实现巴豆酸合成的质粒A，其包含3-酮硫裂解酶(PhbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(AtoB)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)、巴豆酸酶(Crt)和硫酯酶(YdiI)的基因；

B.构建用于表达天冬氨酸氨裂合酶(AspB，或称氨基裂合酶)的质粒B；

C.将对步骤A中所构建的质粒A和步骤B中所构建的质粒B共转入大肠杆菌中，得到阳性克隆；

D.从步骤C中所构建的阳性克隆中，筛选出生产R-3-氨基丁酸的菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒A的构建包括下述步骤：

A-1.将3-酮硫裂解酶基因phbA、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB、巴豆酸酶基因crt和硫酯酶基因ydiI用核糖体结合位点(ribosomebinding site，RBS)序列rbs串联起来，得到表达这4个基因的表达元件phbA-phbB-crt-ydiI；

A-2.将步骤A-1中所构建的表达元件phbA-phbB-crt-ydiI装载到载体pTrcHis2B的BamH1/HindIII位点之间，Trc启动子下游，获得pTrcHis2B-ABcy质粒即质粒A。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达元件phbA-phbB-crt-ydiI的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒B的构建包括下述步骤：

将天冬氨酸氨裂合酶基因AspB克隆到载体pCDFDuet-1的NcoI/NotI位点之间，T7启动子下游，获得pCDF-AspB质粒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸氨裂合酶AspB的氨基酸序列为SEQ ID NO:2(专利文献CN110791493A中报道的SEQ ID NO:3)，其编码基因为SEQ ID NO:3(专利文献CN110791493A中报道的SEQ ID NO:4)。

6.一种R-3-氨基丁酸生产菌，其通过如权利要求1-5中任一项所述的方法构建得到。

7.如权利要求6所述R-3-氨基丁酸生产菌，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22076。

8.如权利要求7所述R-3-氨基丁酸生产菌用于生产R-3-氨基丁酸的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，通过如权利要求7所述R-3-氨基丁酸生产菌CGMCC No.22076的发酵来生产R-3-氨基丁酸。

10.如权利要求6所述的用途，其特征在于，发酵培养基组成如下：125mM MOPS(pH7.4)，20g/L甘油或者葡萄糖，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5mM泛酸钙，2.78mM Na₂HPO₄，5mM(NH₄)₂SO₄，30mM NH₄Cl，5g/L CaCO₃。