[发明专利]一种真核重组质粒及其应用

说明书

本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种真核重组质粒，所述真核重组质粒为SlSUVH3组成型过量表达载体，所述SlSUVH3组成型过量表达载体由SUVH3基因与pBI121载体连接而成；本发明还公开了制备方法和应用。本发明为延长番茄果实货架期提供了一种新的真核重组质粒，其可使果实硬度增加、果皮变厚、果实失重缓慢，可降低果实软化速率，增强果实抗菌能力，延长番茄果实货架期，有利于番茄果实的运输和贮藏，室温下番茄果实可贮藏40多天，比野生型延长了约20天；本发明所用的基因为番茄本身所自有的基因，最终获得的转基因番茄的安全性能高。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种真核重组质粒及其应用。

背景技术

果实软化加剧了果实在运输、加工过程中的损失，降低了消费者的接受度，缩短了货架期，提高了采后果实的感病率。果实成熟过程中，有一系列的生理生化反应，包括细胞壁的降解、呼吸速率的变化、内含物以及其他的代谢变化。果实成熟也是一系列基因表达的结果，除了直接参与细胞壁降解的基因对果实软化有影响外，一些通过甲基化、泛素化、磷酸化、SUMO化和乙酰化等途径调控果实发育的基因也影响果实的软化。

植物SET结构域蛋白功能复杂，参与染色体的浓缩和分离、基因的转录调节以及DNA的复制和修复等众多的细胞反应过程，对植物的发育起着重要的作用。CURLYLEAF(CLF)基因是植物中发现的第一个含SET结构域的基因，能抑制花的AGAMOUS基因的转录，影响花的开花时间和形态，在拟南芥中的茎、叶、花序和花等组织中都有表达。据报道，烟草NtSET1异位表达增强了H3K9的甲基化，抑制植株生长。对水稻SET蛋白研究发现，敲除SDG728后，改变了种子大小，使种子小于对照。而水稻SDG714下调后植株的毛状体变大，过量表达后表现出矮化的株型，拟南芥中SUVH2过表达后也表现出植株矮化。这些研究表明了SET蛋白参与植物生长发育调控，也说明了组蛋白H3K9甲基化对植物发育的调控起重要作用。组蛋白甲基化和DNA甲基化在机体生长发育过程中对染色质形成和基因表达起重要作用。

防止果实采摘后过度软化，延长果实货架期是规模化生产的一个重要环节，现有技术主要采用化学试剂和物理方法来延长果实货架期。由于番茄果实货架期特性与果实硬度有密切关系，又因为果实在储藏过程中会感染病菌，进而会加速果实腐坏，因此，发明人利用基因工程技术，从提高番茄果实硬度和增强果实抗病菌能力两个方面着手来延长番茄货架期。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种真核重组质粒及其应用，本发明构建的质粒载体通过改变与番茄果实细胞壁的大小、硬度、细胞壁及抗菌途径相关的基因的表达来延长番茄果实的货架期，提高了番茄果实的抗菌能力，延长了番茄果实货架期。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种真核重组质粒，所述真核重组质粒为SlSUVH3组成型过量表达载体，所述SlSUVH3组成型过量表达载体由SUVH3基因与pBI121载体连接而成，所述SUVH3基因序列见SEQ ID NO.1。

进一步的，所述SUVH3基因位于pBI121载体的T-DNA区域中的CaMV35S启动子的后面。

为解决以上技术问题，本发明还提供了真核重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

S1：根据SUVH3的基因序列分别设计外侧引物和内侧引物，通过PCR扩增获得SUVH3基因序列，其中外侧引物包括SUVH3-OE-F和SUVH3-OE-R：

SUVH3-OE-F：5’-TTTGGGTTATTCATGTGAGTGG-3’；

SUVH3-OE-R：5’-ATATCATCGACTAGCAGAAGCCG-3’；

内侧引物包括带酶切位点XbaI和MluI双酶切的SUVH3-OE-F1+SUVH3-OE-R1：

SUVH3-OE-F1：5’-GATCTCTAGAATGGAGCAAGGCTTTGGTTC-3’；