[发明专利]一种基于Cas蛋白的检测方法

说明书

本发明涉及一种基于Cas蛋白的检测方法，包括以下步骤：S1、根据目的基因设计合成PCR扩增引物；并根据PCR扩增引物合成crRNA；S2、采用PCR扩增引物对目的基因进行PCR扩增，得到扩增产物；后用Cas蛋白、crRNA和荧光探针体系检测扩增产物；所述引物的序列中包含PAM序列和crRNA识别区序列。本发明突破了PAM序列和crRNA的限制，即使待测突变位点附近无PAM序列或不能设计出合适crRNA的情况下，也能通过引物人工引入PAM序列和crRNA进而进行检测。且引物介导的Cas12a定性检测能在1个反应体系内检测多个变异位点，体现了多重检测的能力，有利于减少操作步骤，降低检测成本。

技术领域

本发明涉及一种用于基于Cas蛋白的核酸分子检测方法。

背景技术

普遍存在于细菌和古细菌中的成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindrome repeats,CRISPR)和CRISPR相关核酸酶(CRISPR associated proteins,Cas)是细菌抵抗外源质粒或噬菌体感染的防御体系，科学家们相继发现了多种Cas蛋白及其工作机制。Cas12a(又名Cpf1) 在crRNA引导下特异识别靶双链DNA(double stranded DNA,dsDNA)并被激活，活化后的Cas12a既能特异地切割靶dsDNA分子，又能非特异地切割无关的单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)，即附带切割活性。

利用Cas12a的附带切割活性检测靶dsDNA分子，现有技术方案原理：①根据待测靶dsDNA分子序列设计引物，通过PCR或等温扩增方法扩增靶dsDNA分子，如果靶dsDNA分子存在则扩增体系中将出现靶dsDNA分子的扩增产物，②根据待测靶dsDNA分子序列设计并合成crRNA，引到Cas12a识别靶 dsDNA分子，③取扩增体系反应液，与Cas12a、crRNA和探针ssDNA(荧光探针)共孵育，④孵育结束后通过仪器检测是否有荧光信号判断Cas12a是否被激活，从而对靶dsDNA分子进行定性检测。

Chen等将Cas12a与重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术结合，Li等将Cas12a与PCR技术结合，分别开发出基于Cas12a的核酸检测技术DETECTER和 HOLMES，基本原理为：根据靶dsDNA设计crRNA，扩增后的靶dsDNA分子可被Cas12a-crRNA复合物特异识别切割，同时激活Cas12a，利用活化后Cas12a的附带切割活性切割ssDNA探针，探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团，探针被切割后释放荧光信号，通过读取探针切割后释放出的检测信号进而检测靶dsDNA(图1)^[1,2]。

但基于Cas12a的核酸检测技术存在以下缺陷：

1.PAM序列限制

Cas12a识别靶dsDNA的第一个前提条件是：靶dsDNA必须存在相应的PAM序列TTTN或TTN。只有当PAM序列存在时，才有可能在PAM序列3’下游设计出crRNA并进行检测(图2)。如果目标序列中无PAM序列时，则不能设计出crRNA，因而不能用Cas12a进行检测。PAM序列极大地限制了目标序列的选择范围和crRNA设计的灵活性。

2.crRNA限制

Cas12a识别靶dsDNA的第二个前提条件是：靶dsDNA必须存在合适的crRNA识别区序列。crRNA 是引导Cas12a识别并决定检测特异性的关键分子。即使检测的目标序列中存在PAM序列，但如果PAM 下游无法设计出特异性高的crRNA(图2)，则可能导致检测的特异性降低，因而不能检测。因为Cas12a 对crRNA与目标序列之间的碱基错配有一定的容许度，这也正是CRISPR/Cas系统在基因编辑中可能脱靶的原因。

3.局限于定性检测