[发明专利]HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用。所述方法包括：i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括sgRNA和Cas9蛋白；ii)使用含有CD17A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。本发明可以提供一种携带HBB基因CD17A＞T突变的细胞，引起的β‑珠蛋白表达缺陷所构建的β‑地中海贫血细胞株的方法，有助于疾病的临床治疗和再生医学研究。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用。

背景技术

β-地中海贫血(β-thalassemia)是最常见的单基因遗传病，且分布范围广泛，是遍布全球的遗传性疾病之一。这种病的主要致病机制是β-珠蛋白合成障碍，β-珠蛋白表达量缺乏或严重减少，使α/β-珠蛋白链比率失衡，不能合成具有正常生物功能的血红蛋白四聚体，造成贫血。严重的β-地中海贫血患者体内无效的红细胞生成增多，出现慢性溶血性贫血，代偿性造血机制被激活，代偿性造血功能亢进，出现在骨髓以外的造血点，如肝脏或脾脏，也可以出现在具有造血潜力的任何器官组织，会增加髓外假性肿瘤形成的风险。在无效红系细胞生成的过程中，红系细胞暴露于衰老抗原如磷脂酰丝氨酸，使其容易形成血栓。地中海贫血患者常出现血小板和凝血系统异常，血液呈高凝状态，且出现相关的血管临床症状如静脉血栓和肺动脉高压等，特别是脾切除的患者。此外，无效红细胞生成导致铁吸收增加，出现由肝脏激素介导的原发性铁超负荷。或由于长期输血引起的铁沉积，可使临床表型进一步复杂化，累及多个器官系统。β-地中海贫血纯合子患者依赖于定期输血和铁螯合剂生存。一个多世纪以来，β-地中海贫血一直是研究的重点，虽然其遗传学分子机制已经得到明确的探讨，但β-地中海贫血的治疗策略在很大程度上仍然只是降低临床症状的严重性，主要治疗手段是定期输血。目前，唯一可使患者痊愈的治疗方法是造血干细胞移植。然而大多数β-地中海贫血患者无法获得人类白细胞抗原匹配的供体，且患者使其面临着严重的异体移植排斥反应，以及免疫抑制手段带来的感染性并发症的风险。

β-地中海贫血的致病基因HBB通常为单个碱基突变或几个碱基的缺失，极少发生大片段缺失，碱基突变常发生在1号外显子区，1号内含子区和2号外显子区，2号内含子区。现有的根治方案是骨髓移植，但骨髓移植存在来源范围窄、配型限制、供体不足等困难之处。因此近几十年研究者们之前致力寻找可替代骨髓移植的β-地中海贫血的治疗方法，如有研究采用携带HBB基因的过表达类型慢病毒进行HBB基因的过表达，让β-珠蛋白表达水平上升，或CRISPR-Cas9基因编辑技术加上寡核苷酸单链诱导HDR发生的方式，进行HBB基因单个突变位点或几个碱基的缺失的修复，从而达到在细胞或动物模型中让β-珠蛋白表达量上升达到缓解疾病表型的目的，但是在这些研究过程中，关于地贫细胞模型的获取主要来源是地贫病人的造血干细胞，即CD34⁺细胞，这种细胞的获取存在如下问题：1、涉及伦理问题；2、取样过程对人体造成创伤；3、造血干细胞体外培养过程最长只能维持21天，不能进行长期的实验处理或实验观察，不是非常理想的细胞研究工具；4、由于产前诊断的发展，重型β-地贫患者的出生率得到很好的控制，病人数量有限。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺点和不足，提供一种相对简易可行的构建β-地中海贫血CD17 A＞T模型细胞株，为后续β-地中海贫血治疗或药物筛选提供可靠细胞实验模型的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明的第一方面涉及制备HBB基因CD17突变细胞的方法，包括：

i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；

ii)使用含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。