[发明专利]一种鱼类卵子的体外保存液及其应用

说明书

本发明公开了一种鱼类卵子的体外保存液，按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液53.63％‑82.87％、鱼血清1.37％‑2.13％和鱼卵巢液15.0％‑45.0％。本发明还公开了鱼类卵子的体外保存液的应用，将离体的成熟鱼类卵子浸泡于所述鱼类卵子的体外保存液中，浸泡的条件为：700‑1000μL/100‑200粒，24‑26℃下浸泡30min‑60min。大大减少了卵巢液的使用，能够有效维持卵胶膜结构和卵子活力，保证了卵子的受精能力，为鱼类卵子体外显微操作和遗传育种研究工作提供了有利条件。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鱼类卵子的体外保存液及其应用。

背景技术

鱼类主要为体外受精、体外发育的繁育方式。大多数真骨鱼类的卵巢为封闭型卵巢，卵巢腹膜所形成的卵巢膜包围，成熟的卵子不落在腹腔而落于卵巢腔中，经输卵管输出体外。成熟排出的鱼类卵外面包有透明胶状保护膜，称为卵胶膜。卵胶膜对于卵和胚胎具重要保护作用：一方面能防御损伤、避免外环境对受精卵的侵害，使胚胎就能在相对稳定的环境中完成各阶段的发育，提高胚胎的成活率；另一方面卵胶膜内的胶质有调节钙离子浓度的作用，保护卵维持正常渗透压，使卵达到最佳受精状态。卵胶膜含有大量的糖蛋白，卵子产出遇水后，卵胶膜吸水膨胀，失去受精能力。卵子在卵巢液中较为稳定，但鱼类卵巢液少、获取量有限。在科学研究及生产实践中，对于精卵产出不同步，尤其是开展卵子体外操作时，维持卵胶膜结构和卵子活力、提高受精发育率是亟待解决的技术瓶颈问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种适用于维持鱼类离体卵子卵胶膜结构和卵子活力的鱼类卵子的体外保存液及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种鱼类卵子的体外保存液，按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液53.63％-82.87％、鱼血清1.37％-2.13％和鱼卵巢液15.0％-45.0％。

上述的鱼类卵子的体外保存液，优选的，所述体外保存液按体积分数计其包含以下各组分：基础培养液68.25％、鱼血清1.75％和鱼卵巢液30.0％。

优选的，所述基础培养液包括以下各组分及其浓度：谷氨酸580-590mg/L、D-葡萄糖0.8-1.5g/L、CaCl₂110-130mg/L、KCl 170-190mg/L、NaCl 6.0-7.0g/L、Na₂HPO₄135-145mg/L、HEPES 0.9-1.0g/L、NaHCO₃2.3-2.5g/L、MgCl·6H₂O 165-175mg/L和MgSO₄·7H₂O65-75mg/L。

本发明是结合鱼类卵子发育特点和卵巢液组成成分分析，制备了一种适用于维持鱼类离体卵子卵胶膜结构和卵子活力的卵巢液稀释剂。稀释剂基础液中Glu(谷氨酸)和D-葡萄糖作为基本营养成分，并和钙盐、钾盐、钠盐、镁盐等无机盐成分维持与卵子内部适宜的渗透势，维持卵胶膜结构鱼血清含有丰富的适合鱼类细胞的营养成分，能够为体外暂存的鱼类细胞提供起稳定和解毒作用的因子，对离体卵起到保护作用。

优选的，所述鱼类卵子的体外保存液的pH值为8.0-8.5，采用的pH调节剂为NaHCO₃溶液。

优选的，所述鱼血清由以下方法得到：将鱼的血液平铺于培养皿中并转入0-4℃冰浴环境下静置3-4h；然后吸取析出的血清，0-4℃、3500-4000rpm离心8-15min，在无菌超净工作台中用过滤网过滤后收集血清，并于-20℃分装保存。

优选的，所述鱼卵巢液由以下方法得到：将鱼卵在常温下6000-8000rpm离心10-15min，收集上清液，-80℃分装保存。