[发明专利]一种向表面富含神经节苷脂的细胞递送重组蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种向表面富含神经节苷脂的细胞递送重组蛋白质的方法，包括以下步骤：制备CtxB‑CfaN和CfaC‑POI；培养待递送重组蛋白的目标细胞；将CtxB‑CfaN和CfaC‑POI稀释为蛋白溶液并共孵育；向目标细胞的培养基内加入蛋白溶液；将加入蛋白溶液的培养基培养后完成重组蛋白的递送。本发明中，B亚基可以通过包涵体纯化的方法预先大量制备出来，并长期在保存，无需针对不同的待递送蛋白片段设计不同的表达载体，虽然操作时需要表达融合了C‑intein的待递送蛋白片段，但相比之下，C‑intein本身长度较短，能够兼容各种纯化方法，提高了操作的便捷性和递送效率。

技术领域

本发明属于蛋白质递送制造技术领域，尤其是一种向表面富含神经节苷脂的细胞递送重组蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质具有十分多样的生物功能，以蛋白质为基础的重组蛋白类药物为疾病的治疗提供了新的手段，使用蛋白药物可以治疗因先天基因缺陷或后天疾病等因素所导致的体内相应功能蛋白的缺失，向细胞内递送某一种特定的功能蛋白也可以用于细胞生物学中信号传导通路的研究。

但是，绝大部分的蛋白质都无法穿过细胞膜进入细胞内部，这严重阻碍了蛋白药物的开发，以及纯化蛋白在细胞通路研究中的应用。事实上，目前市面上几乎所有的蛋白药物都是针对细胞膜和细胞外基质的靶点而发挥作用的，目前还没有能够进入细胞内部从而发挥作用的蛋白药物。

细胞生物学研究中常用的向细胞内递送蛋白的策略是利用纳米颗粒、聚合物或脂质体等载体向细胞内递送蛋白，但是这些载体往往会对细胞或机体造成一定的毒性，通过静脉给药后也不易被身体代谢掉。电转染和显微注射技术可以利用高压电或极细的针头将大分子蛋白递送到细胞内部，但是这些方法需要特殊的仪器辅助，并且仅适用于小规模的细胞生物学科学研究，不适用于蛋白药物治疗。细胞通透肽是一种较为成熟的递送蛋白的技术，但是细胞通透肽递送蛋白效率较低，严重影响了其在蛋白药物中的应用。

综上所述，开发一种能够高效地向细胞内递送重组蛋白质的方法对于疾病的治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种向表面富含神经节苷脂的细胞递送重组蛋白质的方法，该方法利用霍乱外毒素B亚基(cholera toxin B subunit,CtxB)和断裂内含肽(split intein)，不需要依赖于纳米颗粒、聚合物或脂质体等人工合成的非蛋白物质。可以选择性地向表面富含神经节苷脂的细胞(例如神经细胞)递送蛋白质，且递送效率远高于细胞通透肽。对比市面上一些商业用的递送蛋白的转染试剂，该方法可以在含血清的培养基中向细胞内递送目标重组蛋白(POI)，因此最大程度保证了细胞的生长条件不被干扰。

本发明采取的技术方案是：

一种向表面富含神经节苷脂的细胞递送重组蛋白质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

制备CtxB-CfaN和CfaC-POI；

培养待递送重组蛋白的目标细胞；

将CtxB-CfaN和CfaC-POI稀释为蛋白溶液并共孵育；

向目标细胞的培养基内加入蛋白溶液；

将加入蛋白溶液的培养基培养后完成重组蛋白的递送。

再有，所述CtxB-CfaN的蛋白序列为：

MGSSHHHHHHTPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIE RMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANYPYDVPDYAAEYCLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVY TVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP。